嵌合1a与1b亚型包膜蛋白基因HCV细胞培养模型的初步研究

发布时间：2020-01-20 15:30

【摘要】：目的通过构建嵌合丙型肝炎病毒(HCV)1a与1b亚型包膜蛋白基因的质粒,建立嵌合型HCV的体外细胞培养模型,为针对中国HCV主要基因型的抗病毒药物筛选和HCV抗原免疫效果评价提供有效模型。方法1.运用融合PCR技术,通过酶切、重组等手段将中国HCV HeBei分离株(1b)和H77株(1a)的全长包膜蛋白基因(E1/E2)引入JFH1株(2a)基因骨架,构建包膜蛋白基因区相互置换的嵌合病毒(1b/2a和1a/2a)全长基因组质粒;2.HCV(1b/2a)和HCV(1a/2a)全长基因组质粒经Xbal单酶切线性化后体外转录获得全长病毒RNA,将RNA转染Huh7.5.1细胞,进行间接免疫荧光、蛋白印迹实验检测。结果1.成功构建了含嵌合病毒1b/2a、1a/2a全长基因组的重组质粒pHe-Bei(E1E2)/JFH1和pH77(E1E2)/JFH1;2.分别以pHeBei(E1E2)/JFH1和pH77 (E1E2)/JFH1为模板,体外转录获得病毒RNA,将RNA转染人肝癌细胞Huh7.5.1细胞,间接免疫荧光法检测72h后转染阳性细胞率为1%～3%,5d后阳性细胞率为20%～50%; Western blot检测到细胞内HCV非结构蛋白NS3和结构蛋白Core的表达。结论本研究首次在国内建立了嵌合中国HCV分离株(HeBei株)基因的HCV细胞培养模型,病毒RNA可在培养细胞中复制和表达,产生嵌合HCV,嵌合型HCV可以在细胞间传播。
【图文】：

2.3三片段融合PCR以A一S和D一A为引物，分别以回收的Fl、FZ、F3和Fl、F4、FS三个片段混合物为模板，进行PcR扩增，得到2900bP的融合基因片段F6和F7，，片段大小与预期相符(图3)。 H77HeBe1H77HeBei\一//一一﨏﨏

本文编号：2571307