淋病奈瑟菌nspA与1tB融合基因的表达及其重组蛋白免疫活性的初步研究

发布时间：2020-01-22 07:44

【摘要】：目的:在E.coli BL21中表达pET-30a/nspA、pET-30a/ltB及pET-30a/ltB-nspA重组蛋白,纯化复性后,分析其抗原性及免疫原性。通过鼻饲免疫BALB/c小鼠,检测其所诱发的体液免疫(尤其是粘膜免疫应答)和细胞免疫应答水平,为研制新型、高效的淋球菌蛋白疫苗提供实验依据。 方法: 1.转化pET-30a/nspA、pET-30a/ltB、pET-30a/ltB-nspA原核重组质粒,行PCR及双酶切鉴定重组质粒。 2.重组体的表达、纯化及鉴定。诱导重组体pET-30a/nspA、pET-30a/ltB及pET-30a/ltB-nspA在E.coli BL21中表达重组蛋白,优化IPTG浓度和表达时间;Ni+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白;采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物。 3.重组蛋白的免疫活性测定。纯化的重组蛋白透析复性,BCA法测定蛋白浓度,以LTB-NspA,NspA重组蛋白鼻饲免疫4w龄BALB/c小鼠,同时设置重组蛋白LTB及蛋白溶解液(Solution Buffer)对照组,首次免疫的当天,及其后免疫的第2w、第4w和末次免疫的2w后行小鼠尾静脉采血,分离血清及PBS灌洗小鼠生殖道,收集生殖道灌洗液,间接ELISA法检测血清中NspA的特异性IgG水平及生殖道灌洗液中NspA的特异性SIgA水平。末次免疫后2w取小鼠脾细胞于37℃5%CO2培养箱中培养后,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖,分别用ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中的INF-γ和IL-4水平。 结果: 1.将pET30a/nspA、pET30a/ltB、pET30a/ltB-nspA原核表达载体转入E.coli BL21,IPTG诱导后均获得了重组融合蛋白表达,Western-blot分析表达的蛋白均有较强的抗原性,能与抗NspA的特异性抗体结合,其效价达到1:6400以上。 2.重组蛋白免疫后,实验组NspA、LTB-NspA小鼠生殖道粘膜SIgA水平均明显高于对照组LTB、蛋白溶解液组(Solution Buffer)(P0.01);脾淋巴细胞增殖反应测定,蛋白疫苗LTB-NspA组和NspA组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原NspA刺激后,刺激指数分别为(1.63±0.265)和(1.59±0.254),明显高于LTB组(1.11±0.183)、蛋白溶解液组(Solution Buffer) (1.08±0.162)(P0.01),实验组NspA与LTB-NspA间无明显差异(P0.05)。 3.蛋白疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原NspA刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高, NspA组达(134.58±14.17 pg/mL),LTB-NspA组达(142.23±21.25 pg/mL),与LTB组(46.12±5.61 pg/mL)和蛋白溶解液组(6.13±1.06 pg/mL)之间有显著性差异(P0.01),实验组NspA与LTB-NspA间无明显差异(P0.05);两实验组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原NspA刺激后,培养上清中IL-4含量明显升高,实验组的NspA(82.26±7.42 pg/mL)和LTB-NspA(86.14±8.24 pg/mL)明显高于LTB组(36.52±2.34 pg/mL)和蛋白溶解液(Solution Buffer)(31.15±1.32 pg/mL)对照组,差异具有显著性(P0.05); NspA和LTB-NspA两组间IL-4的水平无显著性差异(P0.05)。 结论: 1.原核表达重组体pET-30a/nspA、pET-30a/ltB及pET-30a/ ltB-nspA,在E.coli BL21中成功获得了表达; 2.重组蛋白经鼻饲免疫小鼠后,诱发了一定水平的特异性体液免疫和细胞免疫,实验组LTB-NspA和NspA诱导的IgG、IL-4、IFN-γ水平以及脾淋巴细胞增殖刺激指数,均明显高于对照组; 3.含粘膜佐剂的LTB-NspA所诱发的粘膜特异性SIgA水平明显高于不含粘膜佐剂的NspA;但二者诱导的IgG、IL-4、IFN-γ水平以及脾淋巴细胞增殖刺激指数差异无显著性。
【图文】：

载体经 PCR 和 BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定图谱(1%琼ose gel electrophoresis profile of PCR product and digestant vectors Marker(DL15000);roduct of the plasmid pET-30a/ltB-nspA digested by BamHⅠ roduct of the plasmid pET-30a/nspA digested by BamHⅠ anroduct of the plasmid pET-30a/ltB digested by BamHⅠ androduct of the wild plasmid pET-30a digested by BamHⅠ andCR product of LTB-NspA from the plasmid pET-30a/ltB-nspCR product of NspA from the plasmid pET-30a/nspA;CR product of LTB from the plasmid pET-30a/ltB;p DNA Ladder.

重组体在 E.coli BL21 中的表达组表达菌增菌培养，加入 1.0 mmol/L IPTG 诱导表达 1h、2h菌，SDS-PAGE 显示：重组表达菌泳道均比对照菌泳道多(约 26kD)和 LTB-NspA(约 39kD)，，见图 2；LTB(约 14.4kD 4h 表达趋于饱和。加入浓度梯度的 IPTG(0.5mmol/L，，2.0mmol/L) 在不同的温度下诱导表达， SDS-PAGE 发现乎无影响(图略)。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

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本文编号：2571899