转录因子T-bet特异性shRNA的研制及其对小鼠胶原诱导性关节炎的干预研究

发布时间：2020-02-01 18:03

【摘要】： 研究目的: 探讨T-bet基因在DBA/1小鼠胶原诱导性关节炎(CIA)发生发展过程中的作用,及其作为类风湿性关节炎治疗靶点的可能性。 研究方法: (1)根据国内外文献,应用鸡Ⅱ型胶原诱导DBA/1小鼠,建立胶原诱导的关节炎模型。 (2)构建小鼠T-bet基因特异性的shRNA真核干扰载体和针对无意义序列的对照质粒;通过将干扰质粒转染DC2.4细胞,分析其功能。 (3)以表达T-bet基因的真核质粒及T-bet特异性真核干扰质粒进行关节局部干预,观察各组小鼠关节炎发病时间及成模小鼠的行为改变,并收集各组小鼠关节、脾脏和腹股沟淋巴结。 (4)对病变关节行HE染色及免疫组化染色,观察关节局部滑膜炎症损伤程度及T-bet表达情况。 (5)应用荧光定量PCR法,检测病变关节滑膜、脾脏及淋巴结T-bet和相关炎症因子的表达水平。 研究结果: (1)成功建立了鸡Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎模型,小鼠关节炎的发病率为100%,平均发病时间为35±5天,关节炎症得分为10±2分。 (2)成功构建了针对转录因子T-bet的特异性真核干扰质粒及针对无意义序列的对照质粒。通过对转染有T-bet真核干扰质粒的DC2.4细胞研究表明,与对照组相比,T-bet mRNA及蛋白的表达水平均明显降低,同时DC2.4细胞表达IFN-γ水平亦明显降低。经流式细胞仪分析显示,转有真核干扰质粒的DC2.4细胞,其表面CD80、CD86和MHCⅡ类分子均呈现明显下调。提示,本试验构建的针对T-bet基因的真核干扰质粒,能够有效地抑制T-bet基因的表达,同时相关细胞因子和表面分子的表达水平也发生了相应的改变。 (3)胶原诱导性小鼠关节炎模型鼠的关节局部干预研究表明,在T-bet质粒干预小鼠,其关节局部可因T-bet基因的高表达而明显促进关节炎的发生,发病率为100%,且发病时间提前,一般在诱模的第22天左右发病,平均发病时间为23±2天,关节平均炎症评分3.5±0.5分;在T-bet干扰质粒干预的小鼠,其关节发病率仅为20%,平均发病时间延长为40±5天,炎症评分1±0.5分。 结论: T-bet是Th1细胞特异性的转录因子,在初始T细胞向Th1细胞的分化过程中发挥了极其重要的作用。本试验构建了T-bet特异性真核干扰质粒;经转染树突状细胞系表明,其对T-bet及其相关细胞因子的表达具有明显的抑制作用;胶原诱导性关节炎小鼠模型局部应用的干预研究显示,T-bet质粒关节局部注射后能够明显促进关节炎症的发生,而注射T-bet干扰质粒则使发病率降低、发病时间延迟、炎症程度减轻。提示,T-bet在类风湿性关节炎的发生、发展中起着关键性的作用,干扰T-bet的表达有助于对疾病的控制,也许不失为临床类风湿性关节炎防治的新途径。
【图文】：

图23CIA小鼠发病关节HE染色图片Fig2.3H&EhistologicalanalysisofankleseetionsfrommieeofCIA注:A:CIA，J、鼠的发病关节(100x):B，C，D分别为放大为400x时的不同视野2.2.3CIA‘J、鼠脾脏和关节局部T一bet、I刚详和IL一17的表达水平CIA小鼠脾脏细胞和关节局部组织的T-bet、IFN一Y和IL一17的mRNA水平，均比健康对照小鼠显著增高，统计学处理呈现显著性差异，P值均分别<0.05。见图2.4。

3.2.1酶切结果双酶切后质粒于309/L的琼脂糖进行电泳，连接有T~bet特异性的ShRNA和无关序列对照经过B哪儿万I和 Hindm双酶切后，可见65bp的小片段，，见图3.1。1咬只、二L喊夕65bP图3.1重组ShRNA载体酶切鉴定电泳图 Fig3.lIdentifieationofT一bet一shRNAreeonstructedplasmid M:20bPDNAmarker; 2:doubledigestionofp一下 shRNAbyBa川Hl和 Hind111:3:double digestionofp一nonsense一 shRNAbyBaoHI和 Hind111;4:pGenesil一 1vector3.2.2测序结果重组质粒经上海英骏公司测序，与设计序列完全相符，所含目的基因序列比对准确无误，重组质粒构建成功，序列如下:
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392.11

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本文编号：2575463