联合应用抗原递呈分子基因的汉坦病毒嵌合基因重组腺病毒的构建及表达产物鉴定

发布时间：2020-02-13 20:56

【摘要】： 肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus,HTV)引起,由鼠类等传播的自然疫源性疾病,主要临床特征为发热、出血、肾脏损害,病死率高。我国是世界上肾综合征出血热疫情最严重的国家,年发病人数在2-5万左右,且新疫区不断出现,并时有暴发流行。临床上目前尚缺乏特异有效的治疗药物,因此,HFRS严重威胁着人类的健康。目前我国已经成功研制出三类出血热灭活疫苗,包括乳鼠脑纯化灭活疫苗(HTN型)、细胞培养灭活单价疫苗(沙鼠肾细胞HTN型疫苗、地鼠肾细胞SEO型疫苗)和双价疫苗(HTN型和SEO型)。虽然灭活疫苗的研制成功对预防HFRS的发生和流行起到了积极作用,但通过使用发现该类疫苗仍存在一些问题:主要是其不能有效地刺激细胞免疫应答,此外诱导机体产生中和抗体的能力也较弱,抗体滴度不高。因此研制更为有效的疫苗是预防HFRS发生和流行急需解决的问题。 HFRS的病原体为汉坦病毒,属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae),汉坦病毒属(Hantavirus),是一类有包膜分节段的单负链RNA病毒,基因组包括L、M、S 3个片段,分别编码RNA聚合酶、包膜糖蛋白(glycoprotein, GP)G1和G2、核衣壳蛋白(nucleocapsid, NP)。 M基因编码的GP可诱导机体产生特异性中和抗体,且中和抗原位点主要位于G2糖蛋白上。S基因编码的NP上亦分布有多个抗原表位,此外,NP还可诱导机体产生强烈的细胞免疫反应,参与机体对病毒的清除。研究表明GP的免疫原性较弱,诱导产生的抗体出现较晚且滴度不高。而NP是汉坦病毒结构蛋白中免疫原性最强的,其刺激机体产生的抗体出现早,滴度高,且可诱导机体产生免疫保护。因此将二者融合表达,有望达到优势互补的目的。在之前的研究中,我们将M基因与S基因的0.7Kb片段进行了融合表达,用嵌合基因免疫小鼠,可刺激小鼠同时产生针对病毒的特异性体液免疫和细胞免疫反应。然而在研究中我们也发现了一些问题,如尽管利用各种系统均能表达出完整的融合蛋白,但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外,免疫小鼠后虽然各表达系统均能刺激机体产生体液及细胞免疫应答,且腺病毒表达系统的效果要优于其他系统,但是整体的免疫水平还不十分理想。因此,进一步选择合适的表达载体、优化表达系统并使抗原分子更为有效的递呈,以提高嵌合基因的表达量及其刺激机体免疫应答的能力,是目前HFRS基因工程疫苗研究中急需解决的问题。之前,我们已经将腺病毒表达系统的转录调控结构进行了优化,即引入CAG启动子与WPRE转录后调控序列。实验发现,使用CAG后,腺病毒中嵌合基因的表达水平提高两倍左右且高于单独或同时使用WPRE组。本课题拟在前期已优化转录调控结构的基础上,联合应用抗原加工递呈分子基因HSP70C(热休克蛋白70氨基端片段编码基因)与Ub基因,以进一步提高嵌合基因表达抗原的加工和提呈,特别是进一步提高刺激体液以及细胞免疫应答的能力。 1.转移载体的构建依据Genbank序列,设计引物,PCR扩增得到HSP70C基因和Ub基因并分别克隆入T easy载体测序验证其正确性。随后将HSP70C和Ub分别插入pShuttle-G1S0.7-CAG.、pShuttle-G2S0.7-CAG中,重组的转移载体经限制性内切酶消化后,琼脂糖凝胶电泳分析,阳性克隆命名为pShuttle-G1S0.7-CAG-HSP70C、pShuttle-G2S0.7-HSP70C、pShuttle-G1S0.7- CAG-Ub、pShuttle-G1S0.7-CAG-Ub。 2.重组腺病毒DNA的构建将重组的转移载体用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ酶切后与Adeno-XTM Viral DNA连接,利用PCR鉴定重组的腺病毒DNA。 3.重组腺病毒的包装及鉴定将含目的片段的重组腺病毒DNA转化大肠杆菌进行大量扩增纯化,并测定浓度。利用PacⅠ线性化重组腺病毒DNA后转染HEK293细胞。观察细胞的CPE现象,通过反复冻融裂解细胞获得病毒原种。取病毒原种加入感染HEK293细胞,获得病毒初次扩增产物,并用PCR法鉴定重组腺病毒。 4.重组腺病毒的纯化与滴度测定用病毒初次扩增产物感染单层HEK293细胞,将琼脂糖凝胶与DMED混合物覆盖其上,进行噬斑实验。待出现噬斑后,挑取单斑获得纯病毒。从单层细胞的一个单斑中获得病毒并扩大培养。利用终点稀释法测病毒的滴度,纯化后的重组腺病毒滴度达109pfu/mL。 5.重组腺病毒表达产物的鉴定以100 pfu/cell的MOI感染HEK293细胞,在24-48 h检测细胞中蛋白的表达。免疫荧光结果表明,重组腺病毒感染的HEK293细胞均可被抗汉坦病毒NP的特异性mAb1A8所识别。重组腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-HSP70C及Ad-G2S0.7-CAG-HSP70C感染的HEK293细胞可被HSP70的特异性抗体识别,重组腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-Ub及Ad-G2S0.7-CAG-Ub感染的HEK293细胞可被Ub的特异性抗体识别。
【图文】：

重组质粒,测序,硕士学位论文,PCR扩增

第四军医大学硕士学位论文-41-图2 重组质粒T easy- HSP70C测序后BLAST比对结果Fig.2 BLAST Result of recombinant plasmid T easy-HSP70C3.2 Ub 基因的 PCR 扩增结果以Ub up primer与Ub down primer 为引物，对质粒进行PCR扩增，预期

测序,重组质粒,序列信息

与预期相符合（图3）。将质粒将送至金斯瑞生物科技进行测序，，利用NCBI的BLAST工具与预先获得的HSP70C序列信息进行比对，一致性达100%（图4），阳性克隆命名为T easy-Ub。图 3 重组质粒 T easy-Ub 的 PCR 鉴定结果Fig.3 PCR products of recombinant plasmid T easy-UbM：DL2000 DNA maker；1：T easy-Ub PCR products．图4 重组质粒Ub测序后BLAST比对结果Fig.2 BLAST Result of recombinant plasmid T easy-Ub1 M bp500250100
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392;Q789

【参考文献】