Vero细胞肠道病毒71型灭活疫苗的纯化及鉴定

发布时间：2020-02-19 07:38

【摘要】：目的建立Vero细胞肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗的纯化工艺。方法病毒收获液经离心澄清、福尔马林灭活和超滤浓缩后,采用Sephacryl S-400 HR凝胶过滤层析和Source 30Q离子交换层析2步层析法纯化EV71,进行各项检定及分析后除菌过滤。结果经纯化的疫苗各项纯化指标均符合中国药典2010年版的要求,杂蛋白去除率99.9%;病毒纯化液在电镜下观察到典型的EV71病毒颗粒,经SDS-PAGE及Western blot分析,检测到与文献报道大小相符的EV71 VP1、VP2、VP3及特异性免疫反应;制备成疫苗后免疫大鼠能产生特异性中和抗体。结论本实验建立了Vero细胞的EV71灭活疫苗的纯化工艺,纯化后制备的EV71灭活疫苗具有较好的免疫原性。
【图文】：

n’tproducespecificCPE.3.2抗原含量、蛋白含量和各项残留检测以及杂蛋白去除率分析病毒液经SephacrylS-400HR柱纯化后，病毒抗原和其他杂质获得了较好的分离，病毒抗原主要集中在第2峰(病毒峰)；再经Source30Q柱纯化，进一步去除了宿主DNA及其他微量的残留，第1峰(病毒峰)为目的抗原，结果见图1。纯化后的病毒液进行抗原含量、游离甲醛残留、BSA残留、Vero细胞HCP残留、Vero细胞DNA残留、内毒素含量检测，结果见表2。根据对病毒收获液和病毒纯化液的蛋白质含量的测定，计算出杂蛋白去除率均>99.9%，结果见表3。图1EV71疫苗的柱层析图谱ASephacrylS-400HR柱；BSource30Q柱。Fig.1ChromatographicprofileofEV71vaccineASephacrylS-400HR;BSource30Q.

DNA残留/pg·mL1内毒素含量/EU·mL1201003512001324.8323<10<10201004512002530.0155<100<10201005512002128.776<100<10表3病毒液纯化后的杂蛋白去除率Tab.3Theremovalratesofforeignproteininvirusbulkafterpurification批号病毒收获液病毒纯化液杂蛋白去除率/%体积/L蛋白含量/μg·mL1体积/L蛋白含量/μg·mL1201003202106.60.6857.799.91201004201879.40.6544.099.93201005201984.10.7040.499.923.3HPLC检测纯化后的病毒抗原经HPLC测定，纯度>95%，结果见图2。图2EV71纯化产物的HPLC纯度测定Fig.2PuritytestingofpurifiedEV71byHPLC3.4SDS-PAGE及Westernblot分析SDS-PAGE分析结果显示经SephacrylS-400HR和Source30Q纯化后的病毒产物，纯度得到了显著提高，并观察到与EV71病毒特异性结构蛋白条带VP1、VP2和VP3理论分子量大小的3条条带，结果见图3A和B。病毒纯化产物用EV71特异性鼠单抗进行Westernblot分析，结果呈阳性，结果见图3C。图3EV71纯化产物SDS-PAGE及Westernblot分析ASephacrylS-400HR纯化产物；BSource30Q纯化产物；CEV71疫苗纯化产物。Fig.3SDS-PAGEandWesternblotanalysisofpurifiedEV71ASephacrylS-400HRchromatographyproducts;BSource30Qchromatographyproducts;CpurifiedEV71vaccine.3.5电镜观察结果纯化后的样品进行透射电镜观察，在放大倍数为2~10万倍时能看到病毒颗粒，病毒颗粒呈球形，大小比较均一，直径约为27nm，，符合典型的EV71特征，结果见图4。图4EV71纯化样品的透射电镜图(93000×)Fig.4ElectromicroscopyofpurifiedEV71(93000×)3.6免疫原性检测血清自1∶2开始2倍系列稀释检测中和抗体，首次免疫后2周，血清中出现少量EV71中和抗?

【参考文献】

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本文编号：2580955