脐带间充质干细胞免疫学特性研究及其临床应用初步探讨

发布时间：2020-02-19 14:32

【摘要】： 目的本研究旨在建立一种标准的脐带间充质干细胞(umbilicalcord derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs)分离方法,通过对其基本生物学特性、安全性、免疫学特性及临床治疗移植物抗宿主病作用的研究,以期建立脐带间充质干细胞库及应用于临床。 方法本实验研究分五部分:1.采用双酶法分离脐带间充质干细胞,并通过传代进行纯化和扩增培养,绘制生长曲线;用流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表面抗原及细胞周期;诱导向成骨、脂肪分化以观察其多项分化潜能;采用软琼脂克隆实验以观察其致瘤性;急性毒性实验以观察其急性毒性反应。2.流式细胞术检测其免疫表型;用Brdu法测定细胞增殖率,观察UC-MSCs对异体T淋巴细胞增殖的影响;流式细胞仪检测共培养体系中CD4~+、CD8~+水平;ELISA法检测共培养上清细胞因子IL-4、IFN-γ的表达水平3.以雄性C57BL/6(H  2k~b)小鼠为供鼠、照射后的雌性BALB/c (H  2k~d)小鼠为受鼠,在移植物中混合不同比例的供鼠脾淋巴细胞以诱导急性移植物抗宿主病。根据临床表现、存活期及病理检查等判断GVHD程度,以建立稳定的小鼠aGVHD模型。4.采用雄性C57BL/6(H  2k~b)小鼠为供鼠、铯(Cs)137致死量照射的雌性BALB/c (H  2k~d)小鼠为受鼠建立不同的移植组:照射组、GVHD组、治疗组。根据生存率、临床表现和病理改变判断GVHD程度,并比较不同移植组的存活率、GVHD发生情况。5.于2006年10月～2007年2月,应用脐带间充质干细胞移植治疗3例GVHD患者(急性GVHD患者1例,慢性GVHD患者2例)。从足月儿脐带分离出来间充质干细胞,在体外经过分离培养后,制成脐带间充质干细胞悬液,静脉输注患者体内进行疗效观察。 结果成功建立了脐带间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD29、CD44、CD166、CD105、CD106,不表达造血细胞表型CD34、CD45和CD31;细胞倍增时间为30 h ,细胞周期分析表明,G0～G1期和S+ G2 + M期所占比例分别为78. 84 %和11. 16 % ,脐带间充质干细胞在软琼脂中无克隆形成、无急性毒性反应。从脐带获得的MSCs免疫表型分析显示,其不表达HLA-II抗原、CD80、CD86。对PHA刺激的脐带血T淋巴细胞,UC-MSCs对其的增殖反应具有抑制作用;UC-MSCs与脐带血单个核细胞共培养体系中, CD8+细胞比例降低,与对照组有显著性差异(P 0101),CD4+细胞比例无明显变化(P 0.05);UC-MSCs抑制了共培细胞养体系中IFN-γ分泌,然而促进了IL-4的分泌,与对照组有显著性差异( P 0.01)。异基因骨髓移植组无典型的急性GVHD,aGVHD组的临床评分在8分左右,存活期集中在14-30天,临床和病理均可在相对集中的时间内观察到典型的急性GVHD改变.在动物实验中,发现开始输注间充质干细胞,能够预防和减轻GVHD的发生。和GVHD组比较,治疗组生存期、GVHD临床症状和皮肤病理变化具有明显好转,具有显著性差异(p0.05)。在临床观察中,脐带间充质干细胞输注后所有患者均未见不良反应;随访1月,3例急慢性GVHD例患者具有不同程度恢复。 结论双酶法是一种较好的分离间充质干细胞的方法,培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性,无致瘤性和急性毒性反应,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了实验室依据。UC-MSCs能够抑制PHA刺激的T淋巴的增殖,改变T细胞亚群及T细胞分泌的细胞因子,这种抑制特性表明, UC-MSCs对免疫反应具负调节作用,可能为GVHD的防治以及自身免疫性疾病治疗提供一条新途径,有助UC-MSCs的临床应用。成功地建立了小鼠GVHD模型,可用于评价抗GVHD的治疗效果。UC-MSCs能够减轻急性GVHD的程度和发生。UC-MSCs移植治疗GVHD是一种简单、安全、有效的方法,值得进一步开展临床观察和验证。
【图文】：

test;所有统计学处理均采用 SPSS10.0 统计软件处理，p<0.05 为差异有显著性意义。结 果1 脐带间充质干细胞形态学观察 采用本方法分离的原代细胞多于 24-48 小时内贴壁，培养 3－5 天，倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，6－10 天以后增长速度增快，可见成纤维细胞样克隆形成，，此后增生成为形态相对均一的梭形细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，于第 2-3 周可形成大于 80%融合贴壁细胞层。连续传 20 代，细胞形态无明显改变。而采用文献报道的内皮消化法只有 30%标本可以分离出 MSCs，70%标本贴壁细胞传代不能超过 2 代。（Fig1）。

Channels (FL2-A)0 40 80 120 160 200图 3:脐带间充质干细胞的细胞周期分析78.84 % 细胞在 G0-G1 期 和 11.16%细胞在 S+G2+M 期Fig3. Cell cycle analysis of UC-MSCs78.84% cells in G0-G1 phase and 11.16% cells in S+G2+M phase4 脐带间充质干细胞的免疫表型分析 流式细胞仪检测结果如下(见图 6)：
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 郑志娟;庄文欣;付文玉;;人脐带间充质干细胞的研究进展[J];解剖科学进展;2008年01期

2 范存刚;周景儒;张庆俊;;人脐带间充质干细胞的生物学性质研究进展[J];基础医学与临床;2010年02期

3 马晓生;吕飞舟;姜建元;李小康;;不同基因载体系统对脐带血间充质干细胞转染效果的初步研究[J];复旦学报(医学版);2008年03期

4 陈镭,苗宗宁,张东强,陆华,王玲,栾文忠,惠国桢;人脐血源性间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定[J];江苏医药;2005年07期

5 黄友章;沈建良;宫立众;尹文杰;刘毅;成海;郑培浩;岑坚;;来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年45期

6 李丽艳;杜江;黄金中;;兔软骨细胞诱导人脐血间充质干细胞成软骨的可行性[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年49期

7 姚天华;汤晓雨;杨壮群;李昂;屠军波;马建明;;体外诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化的初步研究[J];中国美容医学;2007年04期

8 王蓓;Marisa Jaconi;BiagioSaittaCoriell;VladimirMarkovCoriell;;体外诱导人脐血间充质干细胞未能向心肌细胞转分化[J];中国心血管杂志;2007年03期

9 管英华;谢扬虎;魏晓巍;李玉云;;脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较[J];中华全科医学;2011年09期

10 李伟中;邱晓燕;邱学荣;王鸿武;林丽敏;蒋学武;唐秋灵;林晓波;马廉;;人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程免疫特性的研究[J];中国小儿血液与肿瘤杂志;2011年04期

相关会议论文 前10条

1 肖宏涛;刘毅;;人脐带血间充质干细胞研究近况及其在脂肪组织工程中的应用[A];第七届全国创伤学术会议暨2009海峡两岸创伤医学论坛论文汇编[C];2009年

2 李云涛;徐燕;葛薇;孟恒星;于珍;李长虹;万长春;李茜;韩俊领;邱录贵;;低血清条件下人脐带血间充质干细胞的分离和鉴定[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

3 孙海梅;季凤清;王丹妮;曾晓蓓;杨慧;;优化脐血间充质干细胞的新方法[A];中国解剖学会第八届组织学与胚胎学教学与科研技术经验交流会论文摘要[C];2008年

4 马兰兰;施萍;庞希宁;;不同胎龄人脐带血间充质干细胞研究[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年

5 张颢;陶艳玲;邱林;张伯龙;马军;陈志哲;刘拥军;韩忠朝;;一种具有免疫负调节功能的人脐带源间充质干细胞[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

6 罗高兴;程文广;黄正根;贺伟峰;袁顺宗;陈希炜;吴军;;应用人脐带血间充质干细胞修复小鼠皮肤缺损创面的实验研究[A];第六届全国烧伤救治专题研讨会论文汇编[C];2009年

7 王巧稚;韩艺;赵宏贤;余鸿;刘广益;;当归诱导人脂肪间充质干细胞向神经细胞分化和毒性检测的研究[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

8 王玉红;陈光辉;;地黄低聚糖对人脂肪组织源性间充质干细胞分泌肝细胞生长因子的影响[A];2010全国中西医结合危重病、急救医学学术会议论文汇编[C];2010年

9 程文广;罗高兴;黄正根;贺伟峰;袁顺宗;陈希炜;吴军;;人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

10 杜凤移;王皓;杨树龙;赵绘存;杨英;杨军;;纳米纤维支架对大鼠间充质干细胞向肝细胞分化的影响[A];天津市生物医学工程学会第29届学术年会暨首届生物医学工程前沿科学研讨会论文集[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 本报记者 胡其峰;揭开脐带血的神秘面纱[N];光明日报;2009年

2 本报特约记者 卫一鸣;脐带血留还是不留?[N];卫生与生活报;2009年

3 本报记者 程国媛;脐带血,这种“保险”需要否？[N];山西日报;2009年

4 本报记者 吴玲娟;你为孩子存脐带血吗?[N];保健时报;2009年

5 南方日报见习记者 徐滔　记者 胡念飞 通讯员 卢松龄;脐带血储存:生命银行还是空头支票[N];南方日报;2009年

6 本报记者 聂国春　整理;脐带血,存还是捐？[N];中国消费者报;2010年

7 本报记者 胡冰心;脐带血,存还是不存？[N];镇江日报;2010年

8 沈敏;收集捐献宝宝脐带血,或可救人一命[N];新华每日电讯;2010年

9 实习生 吴旖旎;脐带血存储能否成为“生命保险”？[N];科技日报;2011年

10 本报记者 黄朝武;世界库容量最大脐带血造血干细胞库在京建成[N];农民日报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 彭飞;620nm非相干红光对大鼠骨髓间充质干细胞的光生物调节作用[D];华中科技大学;2011年

2 于美娇;系统归巢的间充质干细胞在牙周组织修复再生过程中的作用研究[D];山东大学;2011年

3 李东杰;人脐带间充质干细胞促进创面愈合及体外诱导分化为表皮样细胞的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2011年

4 李宝军;脂肪间充质干细胞体外诱导及复合PLGA体内异位成软骨的实验研究[D];中南大学;2007年

5 朱雅姝;Flk-1~+间充质干细胞对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其分子机制研究[D];中国协和医科大学;2008年

6 吴桂珠;脂肪间充质干细胞治疗压力性尿失禁的实验研究[D];福建医科大学;2010年

7 熊卉;转化生长因子β1基因体外转染兔颞下颌关节滑膜间充质干细胞向纤维软骨转化实验研究[D];武汉大学;2010年

8 张颢;脐带间充质干细胞免疫学特性研究及其临床应用初步探讨[D];福建医科大学;2008年

9 苗宗宁;胎盘间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料在骨创伤修复中的实验研究[D];苏州大学;2010年

10 梁伟;人骨髓Flk-1~+间充质干细胞抗DNA损伤物质影响作用研究[D];中国协和医科大学;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 马兰兰;不同胎龄人脐带血间充质干细胞的研究[D];中国医科大学;2010年

2 陈芳;脐带间充质干细胞修复化疗所致卵巢颗粒细胞损伤的体外实验[D];暨南大学;2010年

3 高杨;人脐血间充质干细胞对肝癌转移的影响及机制的探讨[D];昆明医学院;2011年

4 高志买;间充质干细胞高分子量分泌成分对辐射性肠损伤的修复作用[D];安徽医科大学;2011年

5 刘志鹏;大鼠胎盘来源间充质干细胞的生物学特性[D];暨南大学;2011年

6 章守琴;人羊膜间充质干细胞支持造血的体外研究[D];昆明医学院;2010年

7 张茜真;人脐带间充质干细胞的分离、鉴定以及干细胞特异性转录因子诱导其重编程的研究[D];浙江理工大学;2010年

8 陈义;脐带间充质干细胞培养及体外重建角膜后板层的初步研究[D];暨南大学;2010年

9 唐子滨;纳米级胶原基骨材料复合自体脂肪间充质干细胞用于兔后外侧脊柱融合的实验研究[D];河北医科大学;2010年

10 齐凯;人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化初探[D];山西医科大学;2011年

本文编号：2581044