pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白的高效表达、分离纯化及其鉴定

发布时间：2020-02-27 08:12

【摘要】： 目的人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染是引起宫颈癌的主要病因,高危型HPV16是主要的感染类型。而HPV并非宫颈癌发生发展的唯一因素,单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)可能作为协同因子在宫颈癌变发生发展的过程中起重要作用。用PCR法从HPV中扩增出L1基因片段及从HSV中扩增出gD基因片段作为目的基因,并将目的基因插入到pBV220原核表达载体中;为了获得pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白,故将上述重组载体在E.coli DH5α中进行诱导表达、蛋白纯化及其鉴定,以期为研制宫颈癌预防性疫苗奠定基础。方法重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转化E.coil DH5α,温控诱导,以包涵体形式获高效表达。在超声液中加入终浓度为2mol/L的尿素分离洗涤包涵体,然后将其溶于8mol/L尿素中,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。将一定量的目的蛋白与免疫佐剂混合后免疫家兔。免疫方式采用皮下多点注射,经7次免疫后,取兔耳缘静脉血行双向琼脂免疫扩散法检测抗体滴度,滴度合适后,进行心脏采血。采集分离的血清进行双向琼脂免疫扩散,此外,用Western-blot检测和鉴定pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD目的蛋白。结果 1、将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5α,分别经42℃诱导表达6小时和5小时,成功表达了相应的pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。SDS-PAGE分析表明:两者均以包涵体形式存在,pBV220-HPVL1重组蛋白的分子量约为64KD,pBV220-HSVgD重组蛋白的分子量约为13KD。 2、将包涵体超声裂解、分离洗涤后,获得了较纯的目的蛋白,经8M尿素处理后,紫外吸收法测定HPVL1与HSVgD蛋白浓度分别为5.9mg/ml与4.6mg/ml。 3、以pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白分别免疫家兔,制备了抗HPVL1、HSVgD多克隆抗体,以重组蛋白为抗原,用双向琼脂免疫扩散法检测HPVL1、HSVgD抗血清的效价均达到1:16,且HPVL1、HSVgD抗体与免疫原之间形成单一沉淀线,表明所制备的多抗具有良好的纯度。 4、免疫印迹分析HPVL1抗血清在分子量约64KD,HSVgD抗血清在分子量约13KD处与相应的原核表达蛋白呈现特异性结合条带,表明所表达的蛋白均为目的蛋白。结论应用基因工程技术,将重组质粒pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD转入大肠杆菌DH5α,成功地高效表达了pBV220-HPVL1和pBV220-HSVgD重组蛋白。经免疫家兔获得的抗HPVL1和抗HSVgD两种多克隆抗体都具有良好的特异性和较高的抗体效价,为进一步动物实验的研究奠定了基础。
【图文】：

标准曲线,标准曲线

样用加样器吸取样品，分别加入小孔内，以内加入抗原（HPVL1 蛋白/HSVgD 蛋白），周围各依次稀释成 1:2，，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64 清/兔抗 HSVgD 蛋白血清）。育扩散将载玻片平放于湿盒内，置 37℃恒温淀线的血清最高稀释倍数为其抗体效价。果白浓度的测定马斯亮蓝法测定各管的吸光度值，见表 2-3。Tab2-3 考马斯亮蓝法测定各管的号 1 2 3 4 测5950.076 0.137 0.264 0.587 度（ug/ml) 200 300 500 1000 作测定蛋白浓度的标准曲线，见图 2-1
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R392;R737.33

【参考文献】