抗CDK4抗体的IACT筛选

发布时间：2020-02-29 01:11

【摘要】： 周期蛋白依赖性激酶4(cyclin dependent kinase 4, CDK4)作为一种重要的周期蛋白,与肿瘤的发生、发展及患者的预后密切相关,并在多种肿瘤中存在着过度表达和活化。通过反义核酸、导入抗体和降解肿瘤细胞内CDK4蛋白均能阻碍肿瘤细胞的增殖,因此CDK4被认为是肿瘤治疗的重要靶点。 胞内抗体技术(intrcellular antibody or intrabody)通过基因重组技术在细胞内表达抗体分子,并被定位于特定的亚细胞器中,能够特异性地结合细胞内靶分子,进而影响靶分子的加工或分泌及其生物学效应,从而实现特定基因表型敲除,成为一种新兴的基因治疗方法。但由于以往的研究中体外筛选的胞内抗体在真核细胞内环境下常出现不稳定和可溶性降低等现象,抑制了其功能的有效发挥。胞内抗体捕获技术(intracellular antibodies capture technology, IACT)是一种在高通量筛选的基础上,有效分离具有抗原特异性,并可在真核细胞内稳定、可溶表达的胞内抗体筛选技术。 为了制备高效抗CDK4胞内抗体,有效的灭活肿瘤细胞内过度活化的CDK4活性,抑制肿瘤细胞的增殖,本实验通过IACT方法将经过两轮CDK4抗原筛选富集的噬菌体单链抗体基因文库同源重组或连接克隆至酵母表达载体中,获得酵母人源单链抗体文库。并通过酵母双杂交技术共筛选得到25个阳性抗体克隆。 本实验得到的结果对后续开展抗CDK4胞内抗体肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。
【图文】：

重组质粒pGBKT7-CDK4的构建流程

琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，在 T4 DNA 连接酶的作用下与载体片段连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α，提取阳性克隆质粒进行 EcoRI 和 SalI 酶切鉴定分析。琼脂糖凝胶电泳发现，在7300 bp和910 bp处分别出现明显的DNA条带（图3.2），与实验设计基本一致，初步确定 pGBKT7-CDK4 重组质粒构建成功。进一步通过 T 7 Promoter 和 T 7 Terminator 通用引物正反向测序 pGBKT7-CDK4 上的目的片段，测序结果表明，插入序列与实验设计一致，并且读码框完全正确，共 912bp，表达 303 个氨基酸，分子量大约 33.73 kD。3.1.2 pGBKT7-CDK4 的酵母转化为了进行后续酵母双杂交实验及其 IACT 筛选，首先将重组质粒pGBKT7-CDK4 转化酵母 Y187，涂布于 SD/-Trp 培养板上
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R392

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙应飞,樊晓丹,李衍达;真核基因剪接位点二级结构特征[J];清华大学学报(自然科学版);2003年03期

2 夏慧煜,李衍达;真核基因选择性剪接机理的初步研究[J];清华大学学报(自然科学版);2003年04期

3 薛国柱;吕勇刚;窦科峰;;噬菌体抗体库筛选技术及在肿瘤研究中的应用[J];肿瘤防治杂志;2005年23期

4 凌华,丛明,黄慧琴,吕家森,鲍时翔;RT-PCR克隆人血清白蛋白cDNA及其序列分析[J];热带作物学报;2004年04期

5 蔡晓明;朱勇;;家蚕滞育卵浸酸解除滞育研究[J];四川蚕业;2006年01期

6 吴静;张平;周昌华;赵宗容;魏大鹏;章崇杰;;细胞因子受体-抗人AFP嵌合抗体融合蛋白的构建及表达[J];四川大学学报(自然科学版);2008年05期

7 吴静;张平;周昌华;赵宗容;魏大鹏;章崇杰;;细胞因子受体-嵌合抗体真核表达载体的构建[J];四川生理科学杂志;2008年03期

8 张国民;乔媛媛;陈宇萍;吕U，

本文编号：2583624