真皮来源成体多能干细胞的生物学性状与促进创伤修复的实验研究

发布时间：2020-03-17 13:29

【摘要】：干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，是再生医学领域的理想细胞。成体干细胞是存在于发育成熟个体组织中的可自我更新和分化为源组织所有细胞类型的未分化细胞。近年来，研究发现在成体组织中还存在具有向多胚层组织细胞发育潜能的多能干细胞，并已显示出良好的治疗前景。皮肤是人体最大的器官，由上皮组织和和真皮组织组成，包括来源于三个胚层的多种不同的组织细胞，自我更新和再生修复速度快，是成体干细胞分离和研究的良好对象。基于目前对皮肤上皮干细胞(包括表皮干细胞和毛囊干细胞)的研究进展和皮肤上皮组织和真皮组织在发育来源、解剖结构与生物学功能等方面的密切关系，可以推测在真皮组织中也存在干细胞。20世纪90年代，真皮组织干细胞的研究取得了重要进展。国内外的几个研究小组均报道从真皮组织中分离获得了成体多能干细胞，并证实这些细胞具有较强的增殖和分化潜能，可以分化为平滑肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞甚至神经细胞等多种组织细胞，从而为真皮多能干细胞的存在提供了直接的证据。研究还表明，真皮多能干细胞与骨髓基质来源的另一种成体多能干细胞——间充质干细胞在细胞表型等生物学特性方面具有一定差别，因此可排除所研究的真皮多能干细胞为经血循环迁移至皮肤的骨髓间充质干细胞的可能，进一步支持真皮多能干细胞的客观存在。真皮组织来源方便，且可取用自体组织，有望成为细胞移植、基因治疗和组织工程中成体干细胞的一个新来源。创伤愈合是一个复杂的过程，是在多种不同的细胞成分和局部微环境的相互作用下完成的。在创伤愈合的过程中，不同的细胞成分被微环境激活，然后在损伤局部迁移和增殖，参与组织修复。目前的研究表明，体内局部组织特异性的微环境决定了干细胞的可塑性。真皮主要由成纤维细胞和其分泌的富含胶原的细胞外基质成分组成，具有重要的生理功能，同时为皮肤提供支持和营养。鉴于创伤愈合中成纤维细胞的来源仍存在争议，我们设想真皮组织中的多能干细胞可能是成纤维细胞的祖细胞，在创伤后被激活，通过增殖、迁移和分化而参与修复过程。至今为止，关于创伤后表皮细胞、成纤维细胞和内皮细胞的激活过程已经被广泛研究，但对于真皮多能干细胞在爱创伤愈合中的作用和调控机制则所知甚少。同时，作为又一种具有良好前景的成体多能干细胞的来源，真皮多能干细胞是否和目前研究最深入的骨髓间充质干细胞具有类第三军医大学博士学位论文似的功能特性也是值得关注的问题。在本研究中，我们先从人和大鼠的真皮组织中分离鉴定了多能干细胞，进而筛选获得了一纯化的可体外大量扩增的多能干细胞克隆，然后通过一系列实验来揭示其重要生物学特性和在多种不同创伤模型中促进创伤修复与造血恢复的作用。研究结果显示，真皮多能干细胞可以参与创伤修复，并具有促进造血恢复的作用:进一步在放创复合伤动物模型中发现真皮多能干细胞移植可以同时实现提高存活率，，促进造血与创面愈合的多重治疗作用，为复合伤和多发伤等严重创伤的治疗提供了新的思路和途径. 在实验中，我们还发现了体外培养条件下，真皮多能干细胞发生自发恶性转化的现象。鉴于干细胞的恶性转化与其安全应用密切相关，因此对真皮多能干细胞体外自发恶性转化后重要的生物学性状的改变及其发生机制作了进一步研究。本研究取得的主要结果和结论如下: 1、真皮多能细胞的分离、鉴定和生物学性状研究。采用贴壁筛选的方法，从新生大鼠背部和成人包皮与毛囊真皮组织中分离鉴定了成体多能干细胞，经多向分化诱导实验证实其具有多向分化潜能，提示人和大鼠的真皮组织中均含有多能干细胞;在此基础上，采用低密度连续稀释法，从新生大鼠真皮组织中成功获得一纯化的可体外培养扩增的多能干细胞克隆，并对其生物学性状和功能特性进行了研究。免疫细胞化学和流式细胞技术检测细胞表面标志分子结果显示:真皮多能干细胞表达CD44、CD59、 CD90、ICAM一1、VCAM一1、I型胶原和m型胶原等分子，但不表达上皮细胞、血管内皮细胞和造血细胞特异性的pan一eytokeratin、eytokeratinlg、Factor Vlll、cD31、CD45 和CD34等分子，也不表达CD4分子。在成骨、软骨、脂肪和神经细胞特异性诱导体系作用下，真皮多能干细胞表达成骨细胞(碱性磷酸酶和钙盐染色)、软骨细胞(n型胶原和细胞外基质染色)、脂肪细胞(脂滴合成和油红染色)和神经细胞(nestin和NF一200 染色)特异性的标志分子，提示多能干细胞具有多向分化潜能，支持筛选的细胞克隆为多能干细胞。体外培养过程中，细胞增殖迅速;细胞周期检测结果显示:约90%细胞处于GO/GI期，10%处于S期，提示只有少数细胞处于增殖期。传代培养后，细胞呈贴壁状态均匀生长。细胞群体平均倍增周期约40小时，体外培养8一10天即可进入生长的平台期;传代培养至20代，细胞的增殖能力和分化潜能未见明显改变。应用基因芯片对体外培养真皮多能千细胞的基因表达谱进行了研究，检测结果表明:真皮多能干细胞表达多种细胞类型特定的转录子，包括骨细胞、肌肉、成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、胰腺细胞、肝脏细胞、神经细胞、造血细胞等
【图文】：

多能干细胞,真皮,诱导分化,原代培养

图l:(A)体外培养的原代真皮多能干细胞，xloo;(B)细胞周期检测结果采用广谱的分化诱导物一地塞米松来检测细胞的分化能力，结果显示:luM地塞米松作用4周后，细胞钙盐染色和软骨染色均呈阳性，提示分离细胞经诱导可向成骨细胞和软骨细胞分化(图ZA，B);进而选择一种成骨特异性的诱导因子BMP一2作用培养的细胞，结果显示:培养细胞对BMP一2的诱导呈现出明显的反应性，0.lug/mlBMP一2诱导3天后，光镜下可见细胞聚集成簇，既继而细胞分泌黑色颗粒，分泌物堆积成云雾状黑色小节，最后形成钙结节，组织染色证实碱性磷酸酶和钙盐均呈阳性。通过上述结果可以初步鉴定具有多向分化潜能特性的细胞克隆即为真皮多能干细胞。

多能干细胞,诱导分化,包皮,原代培养

部分贴壁细胞成克隆样生长，细胞在最初2周内，生长不明显，但其后增殖加快，融合成片。挑取生长良好的细胞克隆进行诱导分化，4周后，可观察到到钙结节和脂肪细胞的形成(图3)，钙盐染色和脂肪染色也呈阳性，表明人真皮组织中也含有多能千细胞。图3:原代培养人包皮真皮多能干细胞和诱导分化。(A)成骨诱导分化后形成的钙结节;x4o(B)成脂诱导分化后形成的脂肪细胞。‘200进一步从人头皮组织分离毛囊的毛乳头细胞进行培养，可见毛乳头细胞从毛乳头周围长出，向四周呈放射性生长，细胞多为三角形和长梭形，大约2周后细胞融合成片，中央区为多层细胞凝集生长，显示出毛乳头细胞体外具有凝集性生长的特性。为检测是否毛乳头细胞中是否也具有多能千细胞的活性，将单个毛乳头进行培养，待毛乳头细胞生长融合以后，进行诱导分化，结果显示;在培养体系中产生了钙盐染色阳性的成骨细胞和油红染色阳性的脂肪细胞(图4)，而对照未诱导组未能检测出上述染色阳性细胞。由于毛乳头细胞是一类高度特异的成纤维细胞
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R329.2

【引证文献】