高效抗SEB中和保护性抗体的作用及其机制研究

发布时间：2020-03-20 13:52

【摘要】：葡萄球菌肠毒素（Staphyloccucal enterotoxins,SEs）是由葡萄球菌分泌的细菌外毒素，目前已报道的有SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG等二十多种血清型，共称为葡萄球菌SE类超抗原，是细菌性食物中毒、化脓性感染、院内感染的重要毒素。作为一类超抗原，通过桥联结合抗原提呈细胞上的MHC II类分子和TCR的β链V区，形成MHC II类分子:SEs:TCR的三元复合物，直接激活T淋巴细胞，并导致一系列炎症细胞因子的释放，从而引起高热、恶心、腹泻及毒素休克综合征（TSS）。由金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)引起的TSS的病死率可达50%，与流感并发的SEB感染的死亡率更高达90%以上，因此SEB被美国特殊作战处列为常规储存的"标准"（"经典"）生物战剂。目前临床上尚无针对SEB中毒的有效疫苗和药物，而治疗性单克隆抗体因其具有高特异性和低毒副作用的特性，常在SEB的防治过程中被列为首选方案。国内外的多个研究小组也获得了一些鼠源抗SEB的中和性单克隆抗体，但只能达到部分的中和保护效果（63%），其对SEB诱导的T淋巴细胞激活的抑制作用也仅为50-75%；说明单一的单克隆抗体并非是超抗原家族致病过程最理想的抑制剂。而多种中和性抗体的联合应用，虽可实现理想的协同作用，但由于其成分相对复杂、在药效学评价方面需多次进行临床实验等因素，限制了推广和应用。此外，由于多数中和性抗体的结合表位不明确，抗体的中和保护机制尚不明了，使研究难以有突破性进展，因此筛选中和保护性抗体、确定其结合表位，明确其中和保护的作用机制对于研制SEB的治疗性抗体具有十分重要的意义。本项研究旨在利用本实验室已获得的具有中和保护作用抗SEB的单克隆抗体的前提下，进一步通过鼠源3E2与SEB的共结晶，解析了SEB与中和保护抗体的作用界面，明确了SEB与鼠源3E2抗体结合表位的关键位点，初步阐明其中和保护作用的机制；进一步采用基因工程方法构建高效的双可变区（DVD）可同时中和SEB MHC和TCR结合位点的中和性抗体3E2-4A3，研究主要包括三个部分：一、抗SEB中和保护性抗体的作用及其结构基础在前期的研究中，我们通过大肠杆菌原核表达系统融合表达了GST-SEB蛋白，免疫Balb/C小鼠后，采用杂交瘤技术制备了10株具有中和保护作用的鼠源性单克隆抗体，并采用噬菌体12肽库表位淘选了其中具有较高结合力的四株抗体，初步确定了m4A3、m3C1结合于SEB的TCR功能域，m3E2抗体结合于SEB的MHC II类分子功能域，m1A5结合于MHC II类分子功能域的附近。m3E2抗体的亲和力略高于其它三株。为了进一步确定m3E2抗体的中和保护作用的中和表位，我们将m3E2抗体与SEB做了共结晶，通过解析发现m3E2抗体主要结合于SEB MHC II类分子的结合功能域44FLYF47和71KDLADK76。我们将这几处位置的氨基酸做了定点突变并在大肠杆菌原核表达系统中表达了突变体蛋白，通过ELISA、Western blot、3H增殖实验及体外抑制细胞因子释放实验，证实SEB46Y和71K为m3E2与其结合的关键氨基酸。进一步我们分别将46Y突变成E/F/L/M，将71K突变成N/Q/R，通过Biacore测定其亲和力，结果发现当46Y突变成E（谷氨酸）、Q（谷氨酰胺）时，SEB与m3E2不结合；当突变成F（苯丙氨酸）、M（甲硫氨酸）和R(精氨酸)时，亲和力基本无变化，提示局部维持疏水环境对维护m3E2与SEB的紧密结合具有重要作用；而当71K突变成L（亮氨酸）、N（天冬氨酸）时，亲和力分别由原来的5.7E-10下降至3.14E-8和1.41E-6。46Y的突变结果提示局部维持疏水环境对维护m3E2与SEB的紧密结合具有重要作用，71K的突变结果说明局部正电荷环境对抗原抗体间的亲和力变化具有重要的意义。二、抗SEB中和保护性抗体的协同作用为了探讨鼠源抗SEB中和保护性抗体的协同作用，我们将m3E2与其他三株中和保护性抗体进行了组合分组，通过3H增殖实验和体外抑制细胞因子释放实验发现，m3E2+m4A3联合应用对T细胞增殖的抑制作用达到73%，m3E2+m3C1的抑制效率为68%，而单用这三株抗体的抑制率平均在60%左右；m3E2+m4A3联合应用对细胞因子IL-2、INF-γ、TNF-α释放的抑制作用分别达到67.4%、68.8%和69%，m3E2+m3C1组的抑制效率为59.7%、64%、61.4%，而它们单用的抑制率平均仅有40%左右，表明m3E2+m4A3和m3E2+m3C1这两组针对SEB不同功能域的抗体联合应用具有协同作用，且m3E2+m4A3联合应用的效果明显优于m3E2+m3C1。而其它几组针对SEB相同功能域的抗体联合应用后，T细胞增殖的抑制率在50%左右，对细胞因子释放的抑制作用仅在32%左右，说明联合应用不同功能域的抗体，对SEB的中和保护作用具有协同作用，而相同功能域的协同作用不显著。三、高效抗SEB双可变区抗体的构建及功能鉴定采用基因工程技术，构建了两种结构的DVD抗体3E2-4A3和4A3-3E2，共转染CHO细胞，瞬转结果显示，DVD3E2-4A3的结合活性要优于DVD4A3-3E2。体内外实验证明，DVD3E2-4A3抗体的体内外中和活性均强于单个亲源抗体。同时发现DVD抗体较单个亲源抗体具有更高的亲和力（10倍），说明其高效的优势不仅是通过对MHCII和TCR功能域的双阻断，而且由于其更高的亲和力，实现了对SEB的高效的中和保护作用。本研究在前期获得了10株SEB特异性单克隆抗体的基础上，通过m3E2和SEB蛋白的共结晶，解析了SEB与抗体的作用界面，通过定点突变证实SEB46Y和71K为m3E2与其结合的关键氨基酸，探讨了抗SEB抗体中和保护作用的结构基础；进一步比较了几株中和保护性抗体的协同作用，发现针对不同功能域的抗体之间具有协同作用，而同一功能域的中和保护性抗体的协同作用不显著；在此基础上，构建获得了可同时结合SEB TCR和MHCII不同功能域的高效双可变区抗体DVD3E2-4A3，并证实其中和保护作用优于双抗体的联合使用。针对双功能表位的双可变区抗体可能成为抗SEB的新的治疗策略，为研制抗SEB新型抗体类药物作出了探索。
【图文】：

序列,二级结构

水、灰尘都可找到。金葡菌所引起的疾病，最常见的有三大类：染，毛囊炎、疖子、严重者可引起败血症、脑膜炎、骨髓感染等染，通过污染的器械用品造成伤口化脓感染，注射部位化脓感染，等症；三是由金黄色葡萄球菌肠毒素引起食物中毒。在美国由肠毒占整个细菌性食物中毒 33%，而在加拿大更是高达 45%，我国每事件也非常多。球菌肠毒素（SEs）是一类由革兰氏阳性细菌葡萄球菌不同菌株分素，目前已报道的大约有二十多种血清型[1-8]，其中金黄色葡萄球因其超抗原的特性以及在中毒性休克综合征发病中的特殊意义而倍序列与 SEC 和毒素休克综合征毒素（TSST-1）40-60%同源，根据氨子量约为 28.5kD，为一单链多肽，蛋白质结构由 5 个 α 螺旋（图组成 2 个区[10、11]，SEB 与 MHCII 结合的区域位于 α 螺旋 5 和 β 片SEB 的 T 细胞受体（TCR）结合区位于其顶部的四个不同区域：α3 的环部；β 片层 4 的尾部和 β 片层与 α 螺旋 5 的环部[13]。

作用机制

图 2 SEB 作用机制外中毒性休克综合征的主要致病毒素。0.004μg/kg 的剂量即可g/kg 的剂量则可引起死亡[17]。人体感染 SEB 后，可引起呼吸困成发热、肺水肿、急性呼吸窘迫症、中毒性休克、多脏器的衰，SEB 也可造成皮肤炎、慢性鼻炎、哮喘等，，其发病机制与 SE反应相关[19-22]。对 SEB 诱导的中毒性休克综合征尚无非常有效的防治手段，IVIG）可减轻 SEB 诱导的炎性疾病的症状[23]。有研究者将一体用于防治小鼠或灵长类动物模型中 SEB 诱导的致死性休克（淋巴细胞活化后细胞因子的释放[24、25]。多个研究小组也已证实具有一定的中和保护作用[26-30]，且抗体滴度的高低跟中和保护究者用识别SEB MHCII或TCR Vβ结合位点的小分子片段来制
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【参考文献】