人类γδT细胞生物学效应的信号转导机制研究

发布时间：2020-03-21 15:51

【摘要】：γδT细胞能够以主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)非限制性方式识别多种肿瘤相关抗原,有效的杀伤肿瘤细胞,并能分泌干扰素(interferon, IFN)-γ等细胞因子。因此,γδT细胞已成为当前恶性肿瘤免疫治疗中一种很有前景的候选细胞。 γδT细胞表面除表达γ和δ链组成的T细胞受体(T cell receptor γδ, TCRγδ)外,还表达自然杀伤(natural killer, NK)细胞的重要功能受体NKG2D。这两种受体分子在γδT细胞对肿瘤细胞的杀伤中发挥重要的作用。目前,大部分文献报导倾向于γδT细胞活化为TCRγδ依赖性的,而NKG2D仅起共刺激作用。然而,为什么单独的TCRγδ刺激即可活化γδT细胞,NKG2D的共刺激作用又是如何发挥的?只有进一步回答这些问题,才能澄清γδT细胞生物学效应(主要为细胞毒效应)的分子机制,尤其是信号转导机制。鉴此,本研究主要针对以下三个科学问题展开：一是γδT细胞杀伤肿瘤细胞的主要效应途径是什么?二是TCRγδ和NKG2D在活化γδT细胞杀伤功能中的具体作用是什么?三是γδT细胞杀伤功能活化的调控机制是什么?本文分以下两部分就上述三个科学问题进行研究。第一部分工作旨在进一步澄清γδT细胞杀伤肿瘤细胞的相关机理。首先,我们比较了穿孔素-颗粒酶和Fas-FasL两条途径在γδ T细胞杀伤肿瘤细胞中的贡献。我们选取了五种不同组织来源的肿瘤细胞作为γδT细胞杀伤途径研究的靶细胞,包括Daudi(人Burkkit淋巴瘤细胞)、G401(人肾癌Wilms细胞)、NCI-H446(人小细胞肺癌细胞)、HR8348(人结直肠癌细胞)和MGC-803(人胃癌细胞)。流式细胞术检测结果表明,这五种不同组织来源的肿瘤细胞表面Fas受体呈现不同程度的表达：Daudi为5.14%、G401为7.24%、NCI-H556为44.10%、HR8348为69.40%以及MGC-803为82.30%。然后,对这五种Fas受体表达水平不同的肿瘤细胞进行穿孔素-颗粒酶途径及Fas-FasL途径的封闭实验。结果表明,封闭穿孔素-颗粒酶途径后,γδT细胞对这五种肿瘤细胞的杀伤能力均显著降低,而封闭Fas-FasL途径对γδT细胞杀伤能力无显著影响。随后的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)结果显示,穿孔素-颗粒酶途径封闭的γδT细胞与靶细胞共孵育后分泌IFN-γ的能力亦显著降低。而Fas-FasL途径封闭后,γδT细胞分泌IFN-y的能力无显著变化。以上结果表明γδT细胞杀伤肿瘤细胞的主要途径为穿孔素-颗粒酶途径。随后,利用激活抗体包被的P815靶细胞杀伤体系,探讨了TCRγδ和NKG2D在活化γδT细胞杀伤功能中的作用,并分析了二者功能存在差异的原因。P815靶细胞杀伤实验结果表明,单独给予抗TCRγδ抗体刺激即可活化γδT细胞,杀伤抗体包被的P815靶细胞,并分泌IFN-γ;而单独的抗NKG2D抗体刺激却不能活化γδT细胞的杀伤功能,也不能引起IFN-γ的分泌。然而,抗NKG2D抗体可以增强抗TCRγδ抗体刺激所引起的γδT细胞的杀伤功能和分泌IFN-γ的能力。流式细胞术检测结果表明,抗TCRγδ抗体和抗NKG2D抗体均可引起γδT细胞的脱颗粒反应；激光共聚焦检测结果表明,单独的抗TCRγδ抗体刺激即可引起γδT细胞裂解性颗粒的极化,单独的抗NKG2D抗体刺激却不能。尽管如此,抗NKG2D抗体可以在某种程度上增强抗TCRγδ抗体所引起的裂解性颗粒极化。结合杀伤实验结果,提示引起γδT细胞裂解性颗粒极化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT细胞杀伤功能方面存在功能差异的主要原因。第二部分研究工作旨在明确调控γδT细胞杀伤功能活化的相关信号通路。首先对γδT细胞杀伤功能相关的活化信号通路进行了研究,主要集中在Vavl信号通路、磷酸脂酶C-γ1(Phospholipase C-γ1, PLC-γ1)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, Erk)信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信号通路等四条与αβ T细胞和NK细胞活化相关的信号通路。运用Western blot技术,证实了单独的抗TCRγδ抗体刺激即可显著性活化Vav1信号通路、PLC-γ1信号通路以及Erk信号通路；而单独给予抗NKG2D抗体刺激则无此作用；在联合给予抗NKG2D抗体刺激时,这三条信号通路的活化显著增强。PI3K信号通路在给予抗TCRγδ抗体刺激或抗NKG2D抗体刺激时均明显活化,而联合给予二者刺激时,PI3K信号通路活化亦未见增强。结合杀伤实验结果,提示Vav1信号通路、PLC-γ1信号通路以及Erk信号通路与γδT细胞杀伤功能密切相关。利用siRNA技术敲低γδT细胞内的Vav1分子表达时,发现γδT细胞对靶细胞的杀伤、IFN-γ分泌以及裂解性颗粒极化能力均显著降低；同时,敲低Vavl亦可显著抑制PLC-γ1信号通路以及Erk信号通路的活化。利用信号通路抑制剂抑制γδT细胞内的PLC-γ1信号通路以及Erk信号通路时,发现抑制PLC-γ1信号通路可显著抑制γδT细胞的杀伤、IFN-γ分泌以及裂解性颗粒极化,而抑制Erk信号通路对γδT细胞的杀伤功能及裂解性颗粒极化均无显著影响,但抑制Erk信号通路可抑制γδT细胞IFN-γ的分泌。此外,抑制PLC-γ1信号通路可显著抑制γδT细胞内Erk信号通路的活化。上述结果提示,Vav1-PLC-γ1信号通路位于Erk信号通路上游,并在γδT细胞杀伤功能活化中具有重要的作用。随后的研究工作证实了Cbl-b在γδT细胞杀伤功能活化中的负调控作用。利用siRNA技术敲低γδT细胞内Cbl-b分子表达时,γδT细胞对靶细胞的杀伤能力、杀伤功能相关的Vav1-PLC-γ1信号通路活化以及裂解性颗粒极化均显著提高；特别值得一提的是,单独的抗NKG2D抗体刺激即可活化与γδT细胞的杀伤功能相关的Vav1-PLC-γ1信号通路,并引起裂解性颗粒极化,提示Cbl-b是单独使用抗NKG2D抗体不能活化γδT细胞杀伤功能的主要负调控因素,亦提示γδT细胞杀伤功能活化需要一个较强的活化信号来克服活化抑制信号；Vav1过表达实验进一步证实了这一点。此外,RNAi实验也证实了Cbl-b是通过抑制Vavl磷酸化而发挥其负调控功能的。综上所述,本研究得出以下主要结论：1、γδT细胞杀伤靶细胞主要通过穿孔素-颗粒酶途径；2、γδT细胞杀伤功能为TCRγδ依赖性的,NKG2D可增强TCRγδ依赖性的γδT细胞杀伤功能；3、引起裂解性颗粒极化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT细胞杀伤功能方面存在差别的原因；4、Vav1-PLC-γ1信号通路与γδT细胞杀伤功能密切相关；5、Cbl-b负调控γδT细胞杀伤功能；6、γδT细胞杀伤功能的活化需要一个较强的活化信号来克服活化抑制信号,最终使γδT细胞发挥杀伤能力。本研究深入揭示了TCR依赖性γδT细胞杀伤活性的分子机制,发现γδT细胞杀伤功能的实现需要经Vav1-PLC-γ1信号通路的活化来消除E3泛素连接酶Cbl-b的抑制作用,为深入阐明γδT细胞生物学效应的作用机制提供了研究资料。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【共引文献】