人胎儿角膜上皮细胞的体外培养和性质鉴定

发布时间：2020-03-29 19:40

【摘要】： 目的 建立人胎儿角膜上皮细胞体外原代培养和传代培养方法,优化人胎儿角膜上皮细胞的培养体系,为构建组织工程角膜提供上皮种子细胞。 方法 一、人胎儿角膜上皮原代和传代培养 1、原代培养 严格无菌操作获取人胎儿角膜片,采用组织块贴壁法(角膜缘部、中央部)、酶消化法原代培养人胎儿角膜上皮细胞。 2、传代培养 角膜缘部的细胞生长融合达80%以上,不同稀释浓度的胰酶/EDTA消化液消化传代分别接种于空板、小鼠3T3成纤维细胞饲养层、胎儿角膜基质细胞饲养层及HTK饲养层,培养液分别采用D/F12、小鼠3T3成纤维细胞条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液。 二、人胎儿角膜上皮细胞培养体系的条件优化 1、三种条件培养液蛋白含量测定与细胞增殖检测 将收集的小鼠3T3成纤维细胞条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品的蛋白含量。 设D/F12为对照组,MTT法检测3T3条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液对人角膜上皮细胞系的增殖能力。 2、牛角膜细胞破碎液蛋白含量测定与细胞增殖检测 将收集的牛角膜上皮细胞、基质细胞及内皮细胞三种细胞破碎液原液使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品的蛋白含量。设D/F12为对照组,MTT法检测含5%、10%、20%不同浓度的三种牛角膜细胞破碎液对人角膜上皮细胞系的增殖能力。 三、人胎儿角膜上皮细胞的性质鉴定 将P3代人胎儿角膜上皮细胞用K3/12抗体进行荧光染色,观察传代细胞是否还保持有角膜上皮细胞的特性。 收集P3代人胎儿角膜上皮细胞总RNA,用角膜基质细胞作为阴性对照,检测K12、Pax6、K15、ABCG2和P75在mRNA水平上的表达情况。 结果 一、人胎儿角膜上皮细胞的生长情况观察 1、原代培养 角膜缘部组织块周围迁出的细胞以圆形或卵圆形为主,排列紧密,生长状态良好;中央部的角膜上皮细胞体积大,以大而扁平的类表层上皮细胞为主,生长状态差;消化法培养可观察到上皮消化成单细胞悬液,但接种后无细胞贴壁。 2、细胞传代 观察不同浓度消化液消化传代的细胞发现,采用0.05%胰酶+0.02%EDTA消化可观察到消化后的细胞大部分成单细胞状态,传代培养后细胞贴壁及增殖良好。 接于HTK饲养层和胎儿角膜基质细胞饲养层上的细胞不易贴壁且细胞不增殖,接于3T3饲养层上的细胞克隆生长,增殖能力强,但继续传代后细胞老化,不再增殖,容易有角膜基质细胞污染。 采用D/F12、HTK条件培养液及胎儿角膜基质细胞条件培养液培养,细胞增殖能力弱,逐渐老化,不能继续传代;采用3T3条件培养液培养,培养3天后,可见形态规则的卵圆形小细胞集落分布于不规则的大细胞间,细胞增殖能力强。传至P4代胎儿角膜上皮细胞仍有较强增殖能力,但小细胞明显减少。 二、人胎儿角膜上皮细胞培养体系的条件优化 1、三种条件培养液对人角膜上皮细胞增殖的影响 用BCA蛋白定量试剂盒对3T3条件培养液、胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液进行蛋白含量测定,结果显示3T3条件培养液组蛋白含量最高。 MTT法检测结果显示3T3条件培养液可明显促进HCEC的增殖,其与胎儿角膜基质细胞条件培养液、HTK条件培养液和D/F12三组差异均有显著的统计学意义。 2、三种牛角膜细胞破碎液对人角膜上皮细胞增殖的影响 用BCA蛋白定量试剂盒对牛角膜上皮、基质及内皮细胞破碎液液体进行蛋白含量测定,结果显示牛角膜上皮细胞破碎液为914μg/ml,牛角膜基质细胞破碎液为953μg/ml,牛内皮细胞破碎细胞液为1252μg/ml。 MTT法检测结果显示5%的牛上皮细胞破碎液、5%、10%牛基质细胞破碎液、10%牛内皮细胞破碎液均可明显促进HCEC的增殖,四组与D/F12之间差异有显著的统计学意义,四组间差异无统计学意义。 三、人胎儿角膜上皮细胞的性质鉴定 1、免疫荧光染色可见P3代的人胎儿角膜上皮细胞K3/12染色阳性。 2、RT-PCR检测显示,P3代人胎儿角膜上皮细胞在mRNA水平上有K12、K15、Pax6、P75和ABCG2的高表达,而角膜基质细胞表达较弱。 结论 一、组织块贴壁法原代培养人胎儿角膜上皮细胞以及小鼠3T3成纤维细胞条件培养液传代培养方法基本建立; 二、人胎儿角膜缘部上皮细胞增殖能力优于中央部; 三、3T3细胞条件培养液能促进角膜上皮细胞的增殖。
【图文】：

图5人胎儿角膜上皮细胞在3T3饲养层上传代生长情况a为P1代人胎儿角膜上皮细胞在3T3饲养层上生长状态:克隆团不断增殖，推挤饲养层细胞而汇合x100b为PZ代人胎儿角膜上皮细胞在3T3饲养层上生长状态:细胞增殖极缓，，细胞老化X100

图5人胎儿角膜上皮细胞在3T3饲养层上传代生长情况a为P1代人胎儿角膜上皮细胞在3T3饲养层上生长状态:克隆团不断增殖，推挤饲养层细胞而汇合x100b为PZ代人胎儿角膜上皮细胞在3T3饲养层上生长状态:细胞增殖极缓，细胞老化X100
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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本文编号：2606430