从双峰驼单域抗体库中筛选蒜氨酸酶抑制活性抗体

发布时间：2020-03-30 05:44

【摘要】：以酶为靶点的新药开发存在巨大潜力,随着分子生物学的发展,提出了更多基于特异性酶抑制剂的药物研发需求。骆驼体内存在一种重链抗体HCAb,尽管缺失轻链和传统抗体重链中的CH1恒定区,却仍具有良好的稳定性和正常识别抗原的能力,而且重链抗体的可变区CDR3较传统抗体相应区域要长,较长的CDR3可形成稳定的大凸环结构,可优先结合酶活性中心位点。通过基因工程技术克隆自骆驼HCAb可变区的VHH单域抗体,已证实可在大肠杆菌和酵母细胞中高效表达,表达产物分子量小,可溶性好,稳定性强,免疫原性弱,组织穿透性好,可作为治疗性酶抑制剂的最佳候选。 双峰驼(Camelus bactrianu)主要分布在我国新疆、青海、内蒙古、甘肃等西部地区及蒙古国,目前还未见双峰驼VHH抗体文库的相关报道。本文采用重链抗体铰链特异引物,从蒜氨酸酶免疫的双峰驼外周血淋巴细胞中,克隆获得两类不同亚型重链抗体IgG2a及IgG3的VHH片段,大小在400 bp~600 bp之间。再将扩增获得的VHH抗体片段连接至噬菌粒pCANTAB 5E表达载体,转化大肠杆菌TG1,构建获得库容为2.8×105cfu的VHH抗体库,以M13KO7辅助噬菌体感染扩增获得噬菌体展示VHH单域抗体库,利用该展示技术将VHH片段与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面,通过三轮生物亲和淘洗,从中初步筛选获得具有蒜氨酸酶特异结合活性的单域抗体片段VHH A4进行原核表达并纯化,经Western blot免疫印迹验证蒜氨酸酶的特异结合活性,酶抑制活性分析显示VHH A4 IC50值约为20 nmol/L,具有显著的酶抑制活性,表明来自双峰驼HCAb可变区的单域抗体库可作为潜在酶抑制剂的筛选平台。由于蒜氨酸酶可催化蒜氨酸产生大蒜素从而对肿瘤具杀伤功效,筛选获得蒜氨酸酶抑制剂对蒜氨酸酶抗体酶制备及其定向肿瘤治疗具有重要意义。
【图文】：

仅为常规抗体的 1/10，其分子高度 4.8nm，直径 2.2nm，，故米抗体（nanobody）。VHH 抗体重要的特征之一是其具有更为合区（CDR），可结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。如的活性中心结构。另外，它还具有易表达，水溶性好，稳定织穿透性好等优点，使得该抗体作为一种小型化的基因工程药物开发等领域有广阔的应用前景。目前基于骆驼重链抗体究在欧美地区已开始成为热点之一，但在国内仍鲜见报道。新主要产地之一，对于双峰驼中重链抗体的研究，可为研发新型便利，也为进一步了解该型抗体在骆驼免疫中的作用提供线来源于骆驼重链抗体的单域抗体在国内外的应用研究现状展即将开展的基因工程抗体改造及其在免疫治疗方面的应用工

抗原特异双峰驼单域抗体及其抗体相关功能研究提供前期粒B 5E 噬菌粒改造载体和大肠杆菌 TG1 由中国科学院生物，M13KO7 辅助噬菌体购自 Amersham Biosciences 公司。p 1，其中 pCANTAB 5E 中的 NotⅠ酶切位点被删除，换成 GGCCTCGGGGGCC，fd3 基因编码噬菌体 g3p 衣壳蛋白。
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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本文编号：2607130