人骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究

发布时间：2020-04-02 11:24

【摘要】： 目的体外培养人骨髓间充质干细胞(MSC),观察体外培养的MSC的生物学特性。探讨骨髓间充质干细胞作为构建组织工程化角膜种子细胞的可行性及其重建角膜上皮的可能性。方法(1)采用全骨髓贴壁培养法对人骨髓间充质干细胞分离,纯化。将细胞接种于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养扩增,传代,进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件。在倒置显微镜下观察培养的人骨髓MSC体外生长的特征,用HE染色,扫描电镜,透射电镜等对细胞进行形态学的观察。(2)对体外培养的人骨髓MSC进行免疫表型鉴定,确定培养的细胞为骨髓MSC。(3)将传代后的人骨髓间充质干细胞接种于去上皮的兔角膜基质上培养诱导分化。免疫荧光检测角膜上皮细胞标志物角蛋白12(Cytokeratin 12,CKl2)的表达。运用体外培养和体内移植的方法使种植在基质片上的细胞复层化。待细胞融合形成单层后,置入插入式培养皿中进行气液界面培养。4周后进行HE染色及免疫组织化学检测,光镜下观察其复层情况。体内复层的过程中,应用浅板层角膜移植的方法。自动板层角膜刀做8.5mm直径,160μm厚的猪角膜基质片。将MSC种植在基质片上,然后移植到去除角膜浅板层160μm厚的新西兰大白兔的角膜基质表面。共做3兔3只眼,4周后处死动物,收集角膜,进行HE染色及免疫组织化学染色检测其复层情况。结果人骨髓MSC可以在体外培养扩增,表现出很强的增殖潜能。流式细胞仪示:培养的人骨髓间充质干细胞CD45阳性率为0.06%,CD34为0.41%,CD44为86.43%,CD29为85.72%,CD105为90.72%。诱导3周后部分细胞表达角膜上皮细胞特征性CK12。运用气液界面培养法进行体外复层的结果显示细胞仍为单层。体内移植4周后细胞可以复层化,与正常角膜上皮较为相似。共做3兔3只眼,2只眼角膜植片保持透明4周,1只眼保持透明1周。结论人骨髓MSC在体外可以成功进行原代和传代培养,体外培养的人骨髓MSC有很强的增殖能力。在本实验的诱导条件下,人骨髓间充质干细胞可以分化为角膜上皮样细胞,体内移植可以使其复层,有可能作为角膜上皮组织工程种子细胞的选择。
【图文】：

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!_.、卜~、，，1编月..内口...日‘、卜_与才卜、云r，尹，图7流式细胞仪检测结果:培养的骨髓间充质干细胞CD45阳性率为0.06%，CD34为0.41%，，CD44为86.43%，CD29为85.72%，CDIOS为9072%.
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R329

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