布鲁氏菌转录组测序分析及sRNA功能研究

发布时间：2020-04-08 03:02

【摘要】：布鲁氏菌是典型的人畜共患胞内寄生菌，牛、羊、猪等家畜感染后能引起流产和不孕，人感染布病引起关节炎、地中海热等。布鲁氏菌病在世界各地广泛流行，危害严重。布鲁氏菌通过呼吸道、消化道和皮肤黏膜等感染宿主，进入宿主后被宿主巨噬细胞吞噬，与巨噬细胞膜相互作用形成BCV吞噬小体，约有10%的布鲁氏菌存活下来。布鲁氏菌在BCV吞噬小体内面临营养胁迫、低pH、低氧等苛刻环境压力，但吞噬小体内同时也为布鲁氏菌提供了一个逃避细胞吞噬、清除的内环境。因此，胞内生存是布鲁氏菌致病的关键环节。本研究通过对体外模拟巨噬细胞内营养胁迫条件与正常实验室培养条件下的布鲁氏菌转录组进行测序，，比较分析营养胁迫条件下布鲁氏菌基因表达的变化，揭示与营养胁迫条件相关的毒力、致病、代谢等分子机制，进而为布鲁氏菌的胞内生存机制研究奠定基础。细菌非编码小RNA（non-coding small RNA，sRNA）是近年来在细菌中发现的一类RNA调控子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用，是细菌适应环境压力的重要调控子。本研究通过转录组测序分析营养胁迫条件下的布鲁氏菌sRNA，同时结合生物信息学预测sRNA，对得到的sRNA进行功能分析，寻找与布鲁氏菌适应胞内压力环境相关的sRNA，揭示sRNA在布鲁氏菌胞内生存中的调控作用。分别在营养胁迫培养基GEM7.0与标准培养基TSB7.0中培养布鲁氏菌标准强毒株16M，提取总RNA进行转录组测序（RNA-seq）。对测序结果进行分析，结果显示，与正常实验室培养条件（TSB7.0）相比，布鲁氏菌16M在营养胁迫条件下，大量基因表达发生明显的改变。3199个基因中，差异表达的基因有689个（21.54%），其中上调表达的基因有308个（9.63%），下调381个（11.91%）。在营养胁迫条件下，参与脂肪酸第一阶段代谢关键酶富集性上调表达，参与脂肪酸第二阶段代谢相关酶都富集性下调表达，表明营养胁迫条件下布鲁氏菌的脂肪酸代谢过程受到了影响。营养胁迫条件下，致病机制与细菌分泌系统相关基因广泛上调，表明营养胁迫与细菌致病性是布鲁氏菌紧密协作（coordinated）的两个特性。营养胁迫条件下，T4SS系统相关基因富集性高表达，进一步证实T4SS对于布鲁氏菌抵抗外界不良环境具有重要作用；OmpR以及信号转导反应调控基因上调，暗示该通路是布鲁氏菌适应营养胁迫的重要组成；O抗原输出系统基因表达水平下调，暗示布鲁氏菌在营养胁迫情况下可能导致光滑型LPS的结构转化成粗糙型。对RNA-Seq方法获得的原始测序结果进行拼装和生物信息学分析寻找布鲁氏菌的sRNA。首先筛选位于基因间区，与邻近基因距离大于20nt，表达量与邻近基因相差15%的peak为候选peak。选取候选peak中高丰度表达的peak，向上游延伸200nt预测转录启动子，向下游延伸200nt预测转录终止子。从其中筛选出具有启动子和终止子的区域为sRNA的表达转录区域。通过筛选分析，最终得到48个sRNA，其中23个位于正链上，25个位于负链上。同时，我们通过转录单元预测法还预测出21个sRNA分子，其中15个位于正义链上，6个位于反义链上。利用northern blot对转录单元预测法预测出的21个sRNA进行验证，结果表明共有15个sRNA存在转录本。由于sRNA多位于基因间区，有可能与邻近的基因存在共转录，我们对这15个Northern blot验证阳性的sRNA与邻近基因的共转录情况进行了分析。结果表明，其中6个sRNA与邻近的上下游基因不在一条链上，肯定是单独转录的；而剩余的9个sRNA则通过RT-PCR的方法进行了验证，结果表明仅BSR5与BSR8与邻近基因不存在共转录，是单独转录的。对单独转录的BSR16和BSR17进行了进一步的研究，首先通过5’RACE与3’RACE寻找BSR16与BSR17的转录起点与转录终点。实验结果表明，BSR16的转录起点为635852，转录终点为636137；BSR17的转录起点为1187596，转录终点为1187668。为了分析BSR16和BSR17的功能，我们构建了BSR16和BSR17的缺失株和过表达株，并对野生株、缺失株和过表达株的相关表型进行了比较分析，主要包括：生长曲线、体外刺激条件下的生存能力、饥饿实验和小鼠体内生存能力等。从生长曲线可以看出，当BSR16或BSR17缺失和过表达时，布鲁氏菌的生长速度减慢，提示BSR16、BSR17与布鲁氏菌的生长代谢相关。巨噬细胞内生存和繁殖是布鲁氏菌致病的关键，巨噬细胞内环境中包含多种杀（抑）菌物质，而布鲁氏菌必须适应这种环境才能在胞内生存和繁殖。因此，我们又分析BSR16和BSR17的缺失株和过表达株在模拟巨噬细胞内环境的多种体外胁迫条件下的生存能力，包括：高盐、高渗透压、氧化应激、酸、热等。实验结果表明，与16M野生株相比，BSR16过表达株16M-BSR16在各种体外胁迫条件下的生存率明显降低，而BSR16缺失突变株仅在高热压力下生存率下降。结果提示，BSR16的过表达可能导致布鲁氏菌抵抗外界环境压力的能力减弱。对于BSR17，在高盐、高热和氧压力条件，BSR17的缺失株和过表达株的生存率均明显降低。而在高渗条件下，仅BSR17突变株的生存率下降；在低pH值条件，仅过表达株的生存率下降。营养胁迫条件是布鲁氏菌在巨噬细胞内生存时遇到的重要环境压力，因此，我们又分析了BSR16和BSR17的缺失株和过表达株在营养胁迫条件下的长期生存能力。实验结果表明，BSR16和BSR17过表达时，布鲁氏菌在营养胁迫条件下的生存能力均明显减弱。为了进一步明确BSR16和BSR17与布鲁氏菌胞内存活能力的关系，我们对BSR16和BSR17的缺失株和过表达株在小鼠体内的生存能力进行了比较分析。实验结果表明，BSR16和BSR17的缺失与过表达均影响了布鲁氏菌在小鼠脾脏细胞内的生存能力，提示BSR16和BSR17的正确表达对于布鲁氏菌在小鼠体内的长期生存是必须的。细菌的sRNA主要通过靶标mRNAs来发挥转录后调控作用，因此，寻找受sRNA调控的靶基因是研究sRNA作用机制的关键。我们首先通过生物信息学对BSR16和BSR17的靶基因进行了预测分析。结果表明，BSR16的靶基因主要涉及物质的转运和代谢、转录、转录后修饰、胞内运输、细胞膜合成、能量产生与转化等；BSR17的靶基因主要涉及物质转运和代谢基因、复制、基因重组和修复、信号转导机制等。其中，多个靶基因与布鲁氏菌的胞内生存能力有关。由于大多细菌sRNA与靶标mRNA的结合依赖于RNA分子伴侣Hfq，因此，我们分析了BSR16与Hfq的相关性。实验结果表明，BSR16与Hfq密切相关，是Hfq依赖性sRNA，当Hfq缺失后，BSR16的表达明显降低。为进一步分析BSR16的功能，我们利用双向电泳-质谱的蛋白质组学研究方法比较了16M和BSR16过表达株的全菌蛋白表达的差异，从蛋白质组水平鉴定BSR16调控的靶基因。研究结果表明，当BSR16过表达后，布鲁氏菌的蛋白表达发生了明显的变化。这些差异表达的蛋白主要涉及：物质转运和代谢、能源产生和转换、转录、翻译、翻译后修饰、细胞膜合成、分子伴侣和信号转导机制等。其中很多与布鲁氏菌的胞内生存和环境压力适应相关。BSR16过表达后，这些靶基因的表达发生改变，最终影响了布鲁氏菌对环境压力的适应能力和胞内生存能力。以上研究结果表明布鲁氏菌内存在一定数量的sRNA，而且sRNA在布鲁氏菌抵抗与适应巨噬细胞内恶劣环境中发挥重要作用。本研究通过对布鲁氏菌在营养胁迫条件下的转录组测序、差异基因表达分析，对布鲁氏菌在营养胁迫条件下的毒力、致病、代谢等分子机制有了一定的认识。结合转录组测序和生物信息学预测对布鲁氏菌的全基因组进行扫描分析，寻找布鲁氏菌的sRNA，并对sRNA在布鲁氏菌适应环境压力和胞内生存中发挥的作用及其调控的靶基因进行了详细的探讨，为研究布鲁氏菌抵抗环境压力及胞内生存机制提供了重要线索。
【图文】：

生存率,突变株,高渗透压,氧化应激

ig.3-14: the survival persent of 16M,16M- BSR16 and 16M-BSR16 under stress conditio由图 3-15 可以看出，在高盐、高渗透压、氧化应激、低 pH 值与热应激条件6M-△BSR17 突变株和 16M-BSR17 过表达株的生存率远低于野生株 16M。在氧化应激 pH 条件下 16M-△BSR17 突变株和 16M-BSR17 过表达株的生存率与野生株 16M 的差化显著，氧化应激条件下 16M-△BSR17 突变株和 16M-BSR17 过表达株的生存率几乎。16M-△BSR17 突变株和 16M-BSR17 过表达株的生存率明显降低的结果表明，BSR缺失与过表达时，在模拟巨噬细胞内环境的刺激条件下的生存率降低、抵抗各种压力的下降，特别是在氧化应激与低 pH 值条件下，影响了布鲁氏菌适应胞内氧化应激与酸碱的能力。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.51;R3416

【参考文献】