中华仓鼠卵巢细胞密码子的研究

发布时间：2020-04-08 11:42

【摘要】：哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的重要宿主，而中华仓鼠卵巢细胞(CHO)是用于真核基因表达的最成功的哺乳动物细胞。但在该细胞中重组蛋白的产量较低，这一直是影响其更广泛应用的一个问题。人们已在选择合适的表达载体和有效的启动子和增强子方面做了大量工作，取得很多进展，同时开始关注外源基因与中华仓鼠卵巢细胞密码子的匹配程度对外源基因表达的影响，因为人们注意到在大肠杆菌和酵母表达系统中，很多实验已经证实在不改变外源基因氨基酸顺序的条件下，尽量使用大肠杆菌和酵母的偏爱密码子，，可明显提高外源基因的表达水平。因此研究CHO细胞密码子使用特点，将为从偏爱密码子角度来探索不同外源基因在CHO细胞表达水平提供新思路，为外源基因在CHO细胞中的高表达奠定理论基础。 中华仓鼠卵巢细胞，是高度特异化细胞，我们目前常用于表达的CHOdhfr细胞株是野型CHO传代细胞经多次诱变的营养缺陷型细胞。而从GenBank中获得的来自中华仓鼠卵巢细胞中cDNA序列数量有限，因此要研究密码子使用特点就需要构建中华仓鼠卵巢细胞cDNA文库以获得更多数量的cDNA序列。本文选取生长旺盛的CHO dhfr细胞，提取高丰度mRNA，合成cDNA连接到pUC18中，建立适用于高丰度mRNA的质粒cDNA文库。根据以前的研究结果，偏爱密码子的选择与基因长短无关，因此随机挑选150个克隆，每个克隆测一个反应平均长度在550bp左右。通过BLAST程序，去除假基因，tRNA和rRNA基因，重复序列基因，非编码区核苷酸序列，重复的cDNA序列等，最后剩下50个合格的编码蛋白质cDNA序列。
【图文】：

仓鼠卵巢细胞cDN的提取和mRNA的从80%一90%成片细0ulDEPC水中，取456，A280=0.258，A23=0A260/A28。在1.7一2.0白质和硫氰酸呱咤的凝胶电泳签定，可见带型清晰，285:RN鼠卵巢细胞总RNA

图2中华仓鼠卵巢细胞cDNA文库酶切分析MI:人一EeoT14digestMZ:DL2000DNAMarker以EcoRI酶切的中华仓鼠卵巢细胞cDNA中华仓鼠卵巢细胞cDNA文库核昔酸序列分析频率是某种密码子在由许多读码框组成的读码框库中出在读码框库中出现的次数之比。.每个物种目前所测得的读码框库的库容量大小不同，但根据数据库CU丁G(corfomGenBank)密码子使用频率的统计发现，在核普酸序密码子使用频率虽有一些变化，但是按照使用频率所确却基本相似.。1992年版CU丁G中华仓鼠密码子使用频个COS，，7，238个核普酸的基础上[77]，而1999年版中的统计用了2，7个COS，109，395个核普酸口]a，但密码很小.以eIu为例可以看出这种趋势。
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R-332

【参考文献】

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1 毕永春;利用哺乳动物细胞表达外源蛋白的研究进展[J];国外医学(分子生物学分册);2001年05期

本文编号：2619295