mTOR通路参与柯萨奇病毒B3诱导的HeLa细胞凋亡机制研究

发布时间：2020-04-11 04:11

【摘要】：目的：分别通过mTOR和P13K抑制剂干预以及基因转染技术建立mTOR及相关通路抑制和其下游分子过表达后CVB3感染HeLa细胞模型,观察CVB3诱导产生细胞病变效应(CPE)和凋亡情况及CVB3复制、凋亡相关分子的变化,以探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在CVB3感染后导致的细胞凋亡中的作用。 方法：首先,选用人宫颈癌细胞株(HeLa)建立经典CVB3感染细胞模型,分别用]mTOR抑制剂—雷帕霉素及P13K抑制剂—LY294002对模型进行干预,采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,半定量PCR, Western Blot检测细胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase-9、Caspase-3及CVB3表达变化；其次,通过细胞稳定转染技术分别构建4EBP1、p70S6K、Aktl和Akt2过表达HeLa细胞系,建立CVB3感染细胞模型,采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,Real-time PCR和Western Blot检测细胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase-9、Caspase-3及CVB3表达变化,免疫荧光及细胞电镜技术检测病毒复制情况。最后应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析,P0.05为差别具有统计学意义。 结果： (1)雷帕霉素、LY294002均可抑制HeLa细胞活性,并呈浓度依赖效应； (2)雷帕霉素、LY294002对CVB3复制的作用不同但均可促进CVB3诱导的细胞凋亡； (3)雷帕霉素和LY294002可阻断CVB3对Bim活性的抑制作用,进一步促进CVB3诱导的Bax活化； (4)雷帕霉素和LY294002促进CVB3诱导的Caspase-9活化,同时促进Caspase-3的自我裂解,以启动Caspase级联反应； (5)空质粒过表达细胞株建立后,以正常HeLa细胞作为对照组进行Western Bloting验证,pcDNA3.1-myc-HisA(-)质粒转染组可见myc标签蛋白的表达； (6)不同基因过表达细胞株建立后,提取细胞总蛋白,以正常HeLa细胞及稳定表达空质粒HeLa细胞为对照组进行Western Bloting验证,可见质粒转染组分别可见4EBP1、p70S6K、Aktl和转基因Akt2表达明显增高； (7)过表达4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2可促进CVB3诱导的细胞凋亡和细胞病变效应； (8)过表达p70S6K、 Aktl或Akt2可促进CVB3mRNA合成而抑制VP1表达,过表达4EBP1则抑制CVB3mRNA合成而促进VP1表达； (9)CVB3诱导的Bim和Bax的表达可被过表达4EBP1、p70S6K抑制,同时可被过表达Akt进一步活化； (10)CVB3诱导的Procaspase-9、Caspase-3自我裂解可被过表达4EBP1、p70S6K激活,同时被被过表达Aktl、Akt2阻断。 结论： (1)mTORC1和P13K被分别抑制后在CVB3诱导的细胞凋亡过程中其调节机制可能不同：P13K抑制剂LY294002通过上调CVB3mRNA和Bim、Bax、Caspase-9和Caspase-3的活性来促进CVB3诱导的细胞凋亡。而与此不同的是,mTOR抑制剂雷帕霉素在调节凋亡分子表达的同时通过上调CVB3衣壳蛋白VP1而非mRNA的表达来促进细胞凋亡。 (2)成功构建真核表达载体pcDNA3.1-myc-HisA(-)及pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1/p70S6K/Akt1/Akt2. (3)应用脂质体成功对各真核表达载体进行了细胞转染,并成功构建稳定过表达pcDNA3.1-myc-HisA(-)及pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1/p70S6K/Akt1/Akt2的HeLa细胞株。 (4)过表达4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2通过不同的机制促进CVB3诱导的HeLa细胞凋亡：过表达4EBP1、p70S6K通过一条不依赖Bim和Bax的凋亡途径促进细胞细胞凋亡,同时过表达4EBP1还可促进病毒的复制；相反,过表达Akt1、Akt2促进细胞凋亡则是通过一条不依赖Caspase家族的凋亡途径。
【图文】：

差异有统计学意义；各浓度组间比较，lOCHiM组P<0.05，差异有统计学意义（表1-8、 1-9,图1-1)。表1 -8不同浓度雷帕霉素对HeLa细胞增殖活性的影响（MTT法）Rapamycin (nM)分组 Sham DMSO, 10 25 50 100MTT 值68.00±4.02b68.58±5.44" 62.48±5.37'' 61.94±4.0广 58.62±4.17''' 49.68±5.03^注：a,与DMSO组比较，^"<0.05; b,与lOOnM组比较，尸<0.05。表1-9不同浓度LY294002对HeLa细胞增殖活性的影响（MTT法）LY294002 (^M)分组 Sham DMSO' 5 10 25 50 100MTTfl 68.00±4.02^ 68.58±5.44'' 50.40±5.44'' 43.44±6.39'^ 41.92±4.60^'' 41.46±5.12''' 33.30±5.35'注：a,与DMSO组比较，P<0.05: b,与 100|Jvl组比较，b6<0.05。0.8 . b b bI I II 11Z Z Z Z / ZRapamycini IliliilA^ ^ ^ ^ ^LY294002图1-1不同浓度雷帕霉素、LY294002对HeLa细胞增殖活性的影响17

论文 第1章雷帕霉素和LY294002对CVB3诱导的HeLa细胞调不同浓度雷帕霉素对HeLa细胞活性的影响，B为不同浓度LY294002对HeLa。a,与DMSO组比较，，_P<0.05; b,与100^11^1组比较，尸<0.05。CVB3在HeLa细胞上扩增并进行病毒滴度测定B3感染HeLa细胞后，约12 h出现明显CPE，2?3天后CPE可达100生CPE时，细胞失去原有正常形态，变圆、变暗，漂浮呈葡萄串样E,至第7天CPE不再进展时^u始统计。实验中CPE阳性率高于50%的百分数为50，低于50%的百分数为0。nench公式，距离比例=(CPE阳性率高于50%的百分数-50) / (C50%的百分数-CPE阳性率低于50%的百分数）= (50-50)/(50-0)=0, =大于50%的阳性百分比的最高稀释度对数+距离比例X稀释度间距得到的值查反对数表。即lgTCID50=9+0=9，TCID50=10_9(图1-2，
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 陈淳媛;孙跃女;杨作成;蔡姿丽;杨敏;;雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞mTOR和eIF-4E表达的调控作用[J];中南大学学报(医学版);2008年07期

2 周虹;黄向阳;杨婷;汪涛;徐丹;文富强;;LY294002对人纤维肉瘤HT1080细胞生长的影响及机制研究[J];四川大学学报(医学版);2010年01期

3 陈淳媛;杨敏;蔡姿丽;孙跃女;杨作成;;雷帕霉素对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞Ⅰ型胶原表达的调控[J];中国新药杂志;2009年13期

4 单广夷;孔垂泽;李军;张哲;陈启光;;雷帕霉素对膀胱癌T24细胞增殖及侵袭能力的影响[J];中国医科大学学报;2011年04期

本文编号：2623135