感染性甲肝病毒的特异性检测和嵌合甲肝病毒的构建

发布时间：2020-04-12 15:02

【摘要】：甲肝病毒是小核糖核酸病毒科肝病毒属的唯一成员，，有着独特的生物学特性。甲肝病毒一般不引起宿主细胞病变，生长缓慢，周期长，最佳产毒培养时间需3至4周，病毒产量不高。这使得对感染性甲肝病毒的检测和滴定变得十分困难和复杂，目前尚没有建立快速的方法。介导蛋白翻译起始的甲肝病毒内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry sites；IRES)的结构和功能也与众不同，被单独划归一类。本研究对检测感染性甲肝病毒快速方法的建立和用异源IRES或5’非编码区替换甲肝病毒相应顺式作用元件的可行性进行了探索。我们提出了通过检测病毒复制时出现的标志物负链RNA中间体来判断感染性病毒存在的新思路，建立了一种快速、特异性地检测感染性甲肝病毒的新方法，即细胞培养／链特异性逆转录聚合酶链式反应法(Integrated cell culture／strand-specific transcriptase-polymerase chain reaction；链特异性ICC／RT-PCR)，其技术路线为病毒经细胞培养后，用链特异性RT-PCR检测负链RNA，以判定感染性甲肝病毒的存在。链特异性ICC／RT-PCR法结合了细胞培养法与分子生物学方法特点，可区分感染性病毒和失活病毒，可将感染性甲肝病毒的检测时间由细胞培养法的3至4周减少到1周左右。该法对感染性病毒有着较好的特异性，滴度为10~(7.0)TCID_(50)／ml的甲肝病毒经灭活后未产生假阳性结果；该法有着较高的灵敏度，可经细胞培养84小时后检测到模拟水样中滴度为10~0TCID_(50)／ml的感染性甲肝病毒。在用该法检测活疫苗样品Ref的感染性滴度时，培养时间为5天的结果为10~(7.83) TCID_(50)／ml，培养时间为8天的结果为10~(8.0)TCID_(50)／ml，与目前常用ELISA法的检测结果(10~(7.67) TCID_(50)／ml)相近。链特异性ICC／RT-PCR法可应用于食品、水与环境病毒安全性的监测，活疫苗感染性滴度的检测和甲型肝炎的分子流行病学研究，也可应用于灭活疫苗的灭活效力与食品、水中对甲肝病毒或肠道病毒消毒效果的评估。原则上，使用相应的引物，链特异ICC／RT-PCR法可用于检测其它感染性小核糖核酸病毒。
【图文】：

甲肝病毒,一步法,基因组,滴度

分别用一步法Rl’-pcR和链特异性Rl’-pCR检测提取自140贝病毒标准样品A(滴度为1;.0“TcIDs沁)l和系列10倍稀释样品(10一，至10一，)的NRA正链样品。如图2所示，经第一轮扩增后，一步法R-rPcR可检测到滴度为1.02“TCIDS了ml的RNA样品;经第二轮扩增后，可检测到滴度为100TcDI5m0l的RNA样品(图3)。但是，用链特异性R-TPCR检测时，二轮扩增8个样品都不产生阳性PCR产物(图4，5)。这表明本研究中采用的标签Rl’-PCR方法有很高的负链特异性，适用于后续实验的甲肝病毒负链RNA检测。同时，一步法Rl’-PCR中第一轮与第二轮扩增的终点结果差两个数量级

甲肝病毒,基因组,特异性

增结oftheseeond田九PlifieationofrdeetetionofHAVvirionPositiveRT一PCR.M，DNAmarkerDLZ，000.Lnaes:8，undilutedsmaPle代Ins夕mlorHAv:7一l，seria一10一几一ddi一utions.Aorrwdenoetrdouest.异ulstofhetfisrtnalPlificationofrdeetctinoofHAVvirion结Positivespeeifie盯一陀R.Lnaes:8，undi一ut“masp一econatini飞afHAV;7一l，serial10一oflddiltllions.M12345678
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R373

【共引文献】