肝脏缺血再灌注损伤机制的探讨及丹参单体保护作用的实验研究

发布时间：2020-04-13 13:40

【摘要】：作为肝移植手术后严重的并发症，缺血再灌注损伤是导致移植后原发性肝功能不全的主要原因。本研究利用离体大鼠肝脏和人肝窦内皮细胞缺血再灌注模型，较为系统地研究了肝窦内皮细胞缺血再灌注损伤的性质和规律；探讨了肝脏缺血再灌注损伤的机制；确定了丹参单体MP-1减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用和途径。主要实验结果如下： 缺血再灌注过程中，大鼠肝窦内皮细胞脱落和肝细胞死亡明显，肝功能显著下降。人肝窦内皮细胞明显死亡，细胞死亡率随缺血再灌注时间的增加而增加，细胞的功能随之下降。 使用琼脂糖凝胶电泳方法未观察到典型的DNA梯形条带；用TUNEL和丫啶橙染色方法，均未见典型凋亡的出现；用流式细胞仪检测经PI标记的DNA，也未观察到凋亡峰。由此可见，本实验模型中，人肝窦内皮细胞不是以典型凋亡为主的变化，而是以细胞坏死为主的损伤。 用RT-PCR技术测定人肝窦内皮细胞TNFα、IL-8的表达发现：缺血再灌注过程中，TNFα、IL-8的mRNA水平显著增加；用ELISA方法检测其蛋白释放也有一致的结果。TNFα和IL-8的蛋白释放与人肝窦内皮细胞死亡率呈正相关(r=0.949，P＜0.05)和(r=0.892，P＜0.05)。 用电泳迁移率阻滞实验观察NF-κB的结合活性显示：缺血再灌注过程中，人肝窦内皮细胞NF-κB的结合活性显著增加，NF-κB的结合活性与TNFα和IL-8的表达呈平行关系。 向培养液内加入外源性TNFα，可促使人肝窦内皮细胞的死亡；还可促进IL-8和ICAM-1的表达以及基质蛋白酶的活性。若加入TNFα的抗体，可减少缺血再灌注时人肝窦内皮细胞的死亡，提高细胞的功能。 缺血再灌注过程中，人肝窦内皮细胞ICAM-1的表达和基质蛋白酶-2的活性以及粒细胞的粘附均以时间依赖的方式增加。粘附的粒细胞使肝窦内皮细胞损伤恶化，而且ICAM-1表达和粒细胞粘附的数量与人肝窦内皮细胞死亡率呈正相关(r=0.95，P＜0.05；r=0.89，P＜0.05)；加入粒细胞进行灌注时，离体大鼠肝脏释放的基质蛋白酶活性进一步增加。
【图文】：

乎全部脱落，肝窦内皮细胞数量(每5个高倍视野内肝窦内皮细胞的平均数)只有9.3士3.5;肝细胞水样变性明显，肝小叶周边区的肝细胞脂肪变性明显，但肝小叶结构尚清楚，部分区域出现肝板破坏，肝细胞坏死(图1.1.c，d)。台盼蓝灌流染色发现:缺血再灌注60分钟后，肝细胞死亡率达29.8士5.8，残存的内皮细胞均已死亡(图1.1.e，，)f。缺血再灌注30和60分钟的肝脏形态未见明显差异，但再灌注60分钟的肝窦内皮细胞数量以及肝细胞死亡率比再灌注30分钟组有显著提高。图1.1.光镜观察离体大鼠肝脏缺血再灌注过程中的结构变化a，b:低温保存后的大鼠肝脏(HE染色x100和x400)。c，d:再灌注后的大鼠肝脏(HE染色x100和x4OO)。e

中国协和医科大学博士论文1.2透射电镜观察离体大鼠肝脏缺血再灌注损伤的超微结构变化缺血再灌注后，肝窦内皮细胞脱落并有粒细胞的粘附(图1.2.a，8000X)腔不规则，肝窦内皮细胞肿胀，核染色质边集浓缩，DISSe腔内有粒细胞浸润;肝窦(图.2.b，300Ox);肝窦腔内有中性粒细胞的粘附(图1.2.c，3000x);肝细胞肿胀，线粒体破裂，内质网和糖原颗粒明显减少(图1.2.d，4000x)。图1.2.透射电镜观察离体大鼠肝脏缺血再灌注损伤的超微结构变化1.3离体大鼠肝脏功能的变化声离体大鼠肝脏功能随再灌注时间的增加有降低的趋势
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R363;R285

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本文编号：2626058