脊髓背角浅层内GABA_B受体的形态和机能研究

发布时间：2020-04-17 03:44

【摘要】： γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统主要的抑制性神经递质，GABA在脊髓背角作用于两种受体：离子型GABA_A受体和代谢型GABA_B受体(GABA_BR)。既往在脊髓背角对GABA_BR的研究表明：①GABA_BR分布于细的伤害性初级传入纤维终末和脊髓背角神经元；②激活这些受体抑制兴奋性递质谷氨酸和抑制性递质GABA在背角内的释放；③由于行为学研究提示GABA_BR在脊髓水平有镇痛作用，所以GABA_BR激动剂baclofen可作为一种候选镇痛药物。但GABA_BR在脊髓背角的形态和机能研究方面，尤其是其镇痛机制方面尚有诸多不明之处。存在的主要问题有：①GABA_BR在脊髓背角神经元的精确定位；②GABA_BR是否对初级传入终末传递的伤害性信息具有特异性调制作用；③GABA_BR发挥抑制作用的细胞内信号转导和离子通道方面的机制；④GABA_BR对下行抑制系统发挥镇痛作用的影响及机制等。我们运用形态学和电生理学研究方法，对上述问题开展了研究。主要结果如下： (1) 利用免疫组织化学染色技术，在光镜下观察到GABA_BR样免疫组化染色阳性(GABA_BR-LI)的胞体、纤维和终末广泛分布于脊髓背角，尤以浅层(Ⅰ、Ⅱ层)内为密集；背根神经节(DRG)内的大多数大、中和小型节细胞均呈GABA_BR样免疫组化染色阳性。电镜下进一步证实位于背角浅层内的有髓(Aβ，Aδ)和无髓(C)纤维的终末均呈GABA_BR样免疫组化染色阳性，背角浅层内亦能见到GABA_BR-LI胞体和树突。上述结果说明脊髓背角浅层和DRG内有密集的GABA_BR-LI阳性结构，GABA_BR样阳性产物可分别定第四军医大学博士学位论文位于脊髓背角浅层内的突触前和突触后部位。另外刀RG 内也有较多 G朋A。R｛I阳性产物（论文1人 p）将神经纤维切断与免疫组织化学染色相结合，对脊髓背角浅层内密集的GABA。RLI终末的来源进行了观察。在脊髓胸段行半横断、切断外周初级传入纤维以及同时行脊髓胸段半横断和切断外周初级传入纤维的情况下，均可致同侧腰髓背角浅层内的GABABR－LI终末明显减少，尤以同时行脊髓胸段半横断和切断外周初级传入纤维时为著，但即使在此时，仍可见背角浅层内有稀疏的GABABR－LI神经元和终末存留。说明背角浅层内的GABABR工1 终末分别来自外周初级传入、脊髓以上的脑结构和背角浅层内的中间神经元。进一步用荧光素逆行追踪与免疫荧光组织化学染色相结合的双标法观察到向脊髓背角投射的GABABRLI神经元主要位于同侧的延髓吻段腹侧部（RVM）、延髓中缝核团和中脑导水管周围灰质（PAG）。由于PAG、RVM和延髓中缝核团是调控脊髓背角内伤害性信息传递的下行抑制系统的主要组成部分，上述结果提示GABABR可能参与对中枢内源性镇痛系统的调控（论文2人 O）改进了制作可带背根的成年大鼠脊髓薄片的方法。利用盲插全细胞电压钳记录技术，在脊髓薄片上可以借助记录和分析突触后电流等途径研究突触传递的机理（论文3）。 K）在脊髓薄片标本上，利用全细胞电压钳技术观察到GABA。R激动剂 baclofen在背角胶状质pG）神经元引起一个缓慢的外向（抑制性）电流；用 G蛋白抑制剂或 K＋通道阻断剂分别抑制或阻断位于突触后的 G蛋白偶联受体或 K＋通道后，此缓慢外向电流消失。提示该抑制性电流是由 baclofen作用于突触后的G蛋白偶联受体引起的（论文4）。baclofen还可作用于突触前终末上的 GABABR，抑制刺激粗（A刊和细（C，AS）初级传入纤维引起的单突触兴奋性突触电流（EPSCS人提示激活位于突触前的 GABABR可抑制兴奋性递质的释放。上述结果不但与我们的形态学结论一致，而且表明GABABR 5 第四军医大学博士学位论文在脊髓背角神经元的突触前、突触后均可发挥抑制作用（论文＊。baclofen 还抑制刺激背根引起的抑制性突触后电流（IPSCs），此结果进一步提示位于脊髓背角的GABABR通过影响抑制性神经递质的释放而参与初级感觉信息的调制（论文4）。刺激SG神经元引起的神经递质释放依赖于细胞外CaZ”的存在和（或）动作电位，但GABABR通过何种机制调控递质的自发释放尚不清楚。己知 baclofen作用于突触前的GABA。R，能够抑制突触前终末递质自发释放。我们进一步的研究表明在无＊“或义电导被阻滞条件下，此抑制作用依然存在。提示baclofen的抑制作用与突触前的＊”或K＋通道均无关。以forskolin 持续激活腺苦酸环化酶或用NEM将G蛋白偶联受体损毁，均可阻断baclofen 的突触前抑制作用：而PKC＃活剂PDBll则无阻断作用。上述结果提示 baclofen通过与突触前的G蛋白偶联受体和（或）cAMP途径递质自发释放，而与PKC无关（论文5）。＊）利用全细胞电压钳方法研究了GABAsR激动剂baclofen对中脑导水管周围灰质（PAG）腹外侧区神经元活动的影响。激活PAG腹外侧区内的 GABABR引起神经元超极化；用 G蛋白抑制剂或 K＋通道阻断剂分别抑制或阻断位于突触后的G蛋白或矿通道后，，该超极化电流减小或消失。提示该电流是激活位于突触后
【图文】：

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2、全细胞记录标本置于灌流槽内，通过下部的投射光，解剖显微镜下可见SG呈半透明状，可很容易地与相邻层次区分(图1一2)。形成膜片钳记录的封接方法与同传统方法相同I’l:用微操纵仪操纵记录电极尖端接近、但不接触标本的sG的表面。通过一个玻璃注射器(总容量20ml)从后部给电极内加正压，以防止电极尖端在脊髓组织内被堵塞。调整好放大器并施予方波刺激，在示波器上可以看到矩形方波。以微操纵仪缓慢推进电极，同时通过示波器监视波形的变化。当电极尖端接近一个神经元胞体时，由于电阻增大，矩形方波幅度减小。此时将注射器正压释放并转为负压吸引即可形成封接。等待约1min，待封接完全形成，再适当加大负压，直至细胞膜被抽破。此时可在示波器上见到神经元特有的电容特征波形，即可判定形成封接的是神经元。解除刺激方波。在钳制电压为一70mV时

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4床叙盗.尸一习’0OP“图1一3在薄片标本上记录到的各种突触电流(A)钳制电压为一70mV时记录到自发的兴奋性突触后电流(EPSCs)。(B)刺激背根可以记录到不同纤维激活引起的eEPSCs。根据传导速度和刺激强度可以判断纤维的类型。箭头指示刺激伪迹，三角指示A6纤维介导的反应，双三角指示C纤维介导的反应。(C)钳制电压为0mV时可以记录到自发的抑制性突触后电流(IPSCs)(上):刺激背根可以记录到刺激引起的eIPSCs(下)。田)和(C)中，箭头指示刺激尾迹，三角指示刺激引起的突触电流。
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R329

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