酵母表面呈现技术体外进化DAF的研究及DAF促衰变机制的探讨

发布时间：2020-04-19 23:08

【摘要】： 为了避免补体的过渡活化以及保护宿主，补体系统被分别表达在液相和膜上的补体调控蛋白严密调控。衰变加速因子是一种重要的膜上补体调控蛋白，，它作用于补体激活前端反应的C3/C5转化酶，通过抑制其组装而加速其衰变。既可以抑制补体的溶破效应，更可阻止C3a、C5a等过敏毒素和趋化因子的产生，因而是一种潜在的理想的补体抑制药物，可用于防治多种疾病过程中补体系统的异常激活。此外，近年来发现表达人DAF（CD55）等补体调控蛋白的转基因动物器官能很好的控制异种移植中由于补体活化所引起的超急性排斥反应，这使其成为补体分子研究中的“明星”。然而， DAF仍存在某些缺陷，比如其有限的衰变加速能力并缺乏Ⅰ因子的辅因子活性限制了DAF的临床应用，其为部分病原微生物受体的角色对异种移植有潜在危险。因而对DAF进行改造是一种较好的选择，也是当务之急。本课题拟从探讨DAF发挥补体调控作用的关键氨基酸入手，运用酵母呈现技术体外进化DAF分子，期望在了解DAF结构与功能的基础上，筛选高活性的抑制补体激活的DAF突变体，最后在实验结果及总结相关资料的基础上对DAF发挥补体调控作用的机制作进一步探讨。实验内容及结果包括以下几方面： 1．天然人DAF分子的酵母细胞表面呈现本课题首先以人DAF cDNA为模板，通过PCR克隆构建了含人天然DAF分子成熟蛋白cDNA的酵母表面呈现载体，并将其转化酵母细胞，诱导天然DAF分子在酵母表面表达。用三株针对DAF不同表位的单克隆抗体，通过免疫荧光、细胞 ELISA、流式细胞检测等技术分别对酵母细胞表面呈现的DAF进行了鉴定。结果显示在酵母细胞表面能检测到与以上单抗结合的DAF分子，说明了DAF分子在酵母细胞表面呈现，并且呈现的DAF分子能正确折叠，形成了天然的构象。这是国内外首次用酵母表面呈现技术在酵毋细胞表面呈现除兔疫球蛋白超家族分子以外的其它天然蛋白分子。 2．SCRS多重序列比较及DAF ＄变位点的涉择通过对补体调控蛋白家族成员、不同种属DAF分子的同源结构单位SCR的氨基酸序列进行多重序列比较，确定了DAF分子中的保守性氨基酸和非保守性氨基酸，并根据己有的实验结果，对DAF分子可能活性位点进行了分析，确定了构建酵母细胞表面呈现库的突变氦基酸位点。 3．基于DAF框架的酵母呈现突变体库的构建与鉴定通过重叠PCR 和大引物PCR引人突变，构建了基于天然DAF蛋白分子框架的酵母表面呈现肽库，并对库的库容、随机性等进行了鉴定。表明所构建的基于DAF 框架的酵母呈现突变体库库容完整、随机性好，符合筛选的要求。这是国内外首次构建的以免疫球蛋白超家族成员以外的蛋白分子为框架的酵母表面呈现肽库。 4．筛选方法的建立以酵母细胞表面的多糖直接活化正常人血清补体，运用抗人 C5b－9的单抗检测末端补体复合物（TCC）在酵母细胞表面的沉积，首次建立了从功能直接筛选酵母表面呈现蛋白突变体的方法，并进一步从功能方面证实酵母表面呈现的天然DAF具有补体调控活性。 5．夹变体的筛选及鉴定利用建立的功能筛选方法，通过流式细胞仪直接检测与分选，从四轮分选后的子库中随机挑选克隆进行功能鉴定。首次从以DAF结构为框架所构建的的酵母表面肽库中筛选到DAF的高活性突变体。并证实了DAF分子的非保守性氨基酸突变可提高其活性。进一步证实了DAF分子表面的正电荷对于其与C3b／C4b的结合性的重要，同时表明位于C3b们4b表面的补体调控蛋白结合区可能是负电荷集中区域。 6．DAF促衰变加速的分子机制初步抉讨通过对本实验结果的分析，结合当前最新的研究进展，在比较DAF与Ba、CZb同源序列的前提下， ·IX· 二首欢提出了比较精细的DAF可能的衰变加速作用的分子机制模型，此模型 ‘首次解释了经典和替代途径所需DAF SCR数目的差异的可能原因、DAF 二聚体的功能、DAF内源性活性的可能原因、突变体活性增高与B因子的关系。总之，我们通过酵母表面呈现技术体外进化DAF，获得的高活性突变体深化了对DAF结构与功能关系的理解，具有重要的理论意义，同时其可能作为新型补体抑制剂运用于临床或作为异种移植中第二代转基因动物的基因来源，具有潜在的实用价值。建立的相关的实验方法完善和发展了酵母表面呈现技术，对开展与补体调控蛋白相关的研究具有重要的参考价值。提出的DAF促衰变机制的模型对进一步研究有一定的指导意义。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：R392-33

【参考文献】