Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化影响的研究

发布时间：2020-04-25 09:46

【摘要】：目的：观测Wnt3a过表达后骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨能力的变化,以及Wnt3a影响BMSCs增殖、分化的相关机制。 方法：通过慢病毒在大鼠BMSCs中分别导入Wnt3a基因和Mock(阴性无功能基因片段)基因；使用荧光显影及Western Blot对导入效果进行鉴定。MTT法分析Wnt3a对BMSCs增殖的作用,进而甲苯胺蓝染色检测基质蛋白聚糖的生成情况,并使用实时荧光定量PCR检测软骨分化标志基因COL2A1、Aggrecan和SOX9的mRNA水平。通过观测β-catenin、Ca2+磷酸化CaMKⅡ等蛋白与离子的变化判断Wnt3a影响BMSCs软骨分化的途径,并使用DKK1和KN93分别抑制经典及非经典途径,以分析各途径在Wnt3a影响BMSCs增殖、分化过程中的作用。 结果：所有BMSCs经慢病毒感染后用荧光显微镜可观察到绿色荧光蛋白表达；Western Blot发现Wnt3a转染BMSCs后,其基因能够表达。MTT分析显示过表达Wnt3a的BMSCs增殖率显著高于对照组(P0.05)；甲苯胺蓝染色显示BMSCs出Wnt3a的过表达降低了基质蛋白聚糖的积累；Wnt3a表达上调同时导致COL2A1、Aggrecan和SOX9的mRNA水平显著降低(P0.05)。Wnt3a的过表达造成了经典途径特异性标志物β-catenin的上调；在过表达Wnt3a BMSCs的细胞质中Ca2+浓度升高(P0.05),并导致磷酸化CaMKⅡ浓度升高(P0.05),而对内源性CaMKⅡ的表达无影响。用特异性抑制剂DKK1阻断了经典途径后发现,BMSCs的增殖回归自然水平,但基质蛋白聚糖进一步减少,COL2A1、Aggrecan和SOX9的mRNA保持在低水平；用特异性抑制剂KN93阻断了非经典途径后发现,BMSCs的增殖能力不受其影响,而且基质蛋白聚糖显著增加,COL2A1、Aggrecan和SOX9mRNA的水平显著上调(P0.05)。 结论：(1)Wnt3a增强了BMSCs的增殖。(2)Wnt3a抑制了BMSCs的成软骨分化。(3) Wnt3a激活了MSC中的经典途径。(4) Wnt3a能够激活非经典的Ca2+/CaMKⅡ信号途径。(5) Wnt3a可通过经典Wnt途径促进BMSCs的增殖,但主要通过非经典的Ca2+/CaMKⅡ途径抑制BMSCs的成软骨分化。(6)经典途径阻断剂DKK1与Wnt3a在抑制BMSCs成软骨分化的过程中发挥了协同作用。
【学位授予单位】：南开大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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本文编号：2640100