BDNF信号通路调节神经元突触形成及递质释放的机制研究

发布时间：2020-05-02 16:59

【摘要】：研究背景和目的：突触是神经元间的特化结构，由突触前膜，突触间隙和突触后膜组成，是维持神经元相互联系的基本单元。正确的突触形成是神经系统结构和功能基础，并受多种因素调节，如神经生长因子，整合素及星型胶质细胞等。BDNF (brainderived neurotropic factor,脑源性神经生长因子)作为神经因子家族重要成员之一，调节和维持神经系统的发育和功能，如促进突触形成。 GIT1(G protein coupled receptor kinase interacting protein-1, G蛋白偶联受体激酶相关作用蛋白-1)是由多个结构域组成的穿梭蛋白，通过影响细胞骨架，调节受体内吞和转运，细胞的粘附和迁移及突触的发育和维持等。GTI1可分别通过整合素，ephrin及scribble等通路调节神经元突触的发育。CaMKII (calcium/calmodulin-dependent protein kinase,钙/钙调素依赖性蛋白激酶)是一种广泛分布于中枢神经系统的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过自己激酶活性或结构特点调节突触的形成和功能成熟。本研究在原代培养的皮层神经元中，，通过点突变，基因转染及免疫共沉淀等技术，研究GIT1与CaMKIIβ是否参与BDNF诱导的突触形成以及其中的分子机制。方法： 1.分离，培养及鉴定大鼠原代皮层神经元。 2. KN-93和GIT1-siRNA分别作用于神经元，检测对突触形成的影响。 3.构建HA-GIT1-WT(wild type，野生型), HA-GIT1(第419丝氨酸突变为丙氨酸，S419A)和Flag-CaMKIIβ质粒，分别转染HEK293T细胞和原代皮层神经元。 4.免疫印迹，免疫荧光及免疫共沉淀检测技术检测目的蛋白的表达和相互作用情况。结果： 1.对培养至第6天的神经元，分别使用神经元特异性抗体β-tubulin III和NeuN进行细胞免疫荧光鉴定，结果显示两个抗体染色均呈阳性。 2.与对照组相比，BDNF显著促进突触形成和p-CaMKIIthr286水平（P0.05）；KN-93和GIT1-siRNA能够明显抑制突触形成（P0.05）；GIT1-siRNA明显抑制CaMKII的磷酸化水平（P0.05）。 3.与GIT1-WT相比，在HEK293T细胞中，GIT1(S419A)与CaMKIIβ结合明显下降（P0.05）；在皮层神经元中，GIT1(S419A)与CaMKIIβ在神经元突起处共定位明显下降（P0.05）。 4.与GIT1-WT相比，GIT1(S419A)明显抑制神经元突触形成。结论： 1.在BDNF通路中，GIT1与CaMKIIβ参与皮层神经元突触的形成。 2.在BDNF通路中，GIT1(S419A)影响GIT1与CaMKIIβ的结合及CaMKIIβ激活；研究背景与目的： BDNF不仅参与神经元突触的形成，还影响突触形成后的功能。神经递质释放作为突触重要功能之一，是神经元之间联系的物质基础。谷氨酸作为一种常见的神经递质，其释放也受BDNF的调控，但具体机制尚不明确。最近的研究表明BDNF与Src在调节神经功能上存在相互关系。Src作为非受体酪氨酸激酶家族成员之一，通过作用于目的蛋白，参与神经递质释放的调节，但是目前，Src对谷氨酸释的调控作用仍存在争议。PLCγ1是PLC丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，当其酪氨酸783位点磷酸化后被激活，参与神经递质的释放。Src和PLCγ1之间存在相互关系，如通过GIT1，Src参与PLCγ1的调节。但是在BDNF通路中，两者的关系还不确定。本研究通过体外培养的皮层神经元，研究BDNF诱导下谷氨酸释放的信号通路，以及BDNF, Src和PLCγ1之间的关系。方法： 1.分离和培养大鼠原代皮层神经元。 2. Trkb, Src, PLCγ1, Akt和Erk1/2的特异性抑制剂K252a, PP2, U73122,LY294002和PD98059处理皮层神经元，检测BDNF刺激条件下的皮层神经元谷氨酸释放。 3.免疫印迹和免疫共沉淀技术检测Trkb, Src, PLCγ1, Akt和Erk1/2的相互关系。结果： 1. BDNF显著增加谷氨酸释放，同时明显增强Trkb，Src，PLCγ1，Akt，和Erk1/2的磷酸化水平（P 0.05）。 2. K252a在抑制BDNF刺激条件下Trkb磷酸化和谷氨酸释放的同时，明显抑制Src，PLCγ1，Erk1/2和Akt的磷酸化水平（P 0.05）。 3. PP2降低BDNF刺激皮层神经元的谷氨酸释放（P0.05），抑制Trkb和PLC-γ1磷酸化水平（P0.05），但对Erk1/2和Akt的磷酸化水平却没有影响（P0.05）。 4. U73122抑制BDNF刺激皮层神经元的谷氨酸释放（P0.05），但对Trkb，Src，Erk1/2和Akt的磷酸化水平没有影响（P0.05）。 5. LY294002和PD98059不影响BDNF刺激的谷氨酸释放，也不抑制Trkb，Src和PLCγ1的磷酸化水平（P0.05）。结论： 1. BDNF通过Trkb/Src/PLCγ1信号通路诱导皮层神经元谷氨酸释放。 2. BDNF作用下，Src被Trkb活化后，再促进Trkb充分活化，充分活化后的Trkb通过提高PLCγ1的磷酸化水平促进谷氨酸的释放。
【图文】：

载体,图谱,掉片,基因突变体

37℃，20min。稀释的一抗，阴性对照用 PBS 代替一抗。水柔，防止细胞掉片），3×2min。稀释的二抗，避光孵育，37℃ 20min。柔，防止细胞掉片），3×2min。剂封片。或激光共聚焦显微镜观察，拍照。GIT1 基因突变体、CaMKIIβ 基因 pIRES2-E 载体图谱如下：

皮层神经元,体外培养,放大倍数,神经元

图 1.2 体外培养至 10 天的皮层神经元（放大倍数×200）皮层神经元的免疫荧光鉴定元行细胞爬片，并将培养至第 6 天的神经元分别使-tubulin III(特异性识别神经元树突)和 NeuN(特异性要分布在神经元核周，胞体和树突起始部)。结果显-tubulin III（图 1.3A）和 NeuN(图 1.3B)广泛识别。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R338

【共引文献】