金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的功能鉴定及表达调控

发布时间：2020-05-04 10:27

【摘要】：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人类多种感染性疾病及食物中毒的重要病原菌之一，它导致的食物中毒和医院感染已经成为世界范围内影响公共卫生与健康的重要问题。耐热核酸酶是金黄色葡萄球菌重要的毒力因子之一，同时也是分离鉴定金黄色葡萄球菌的重要判定指标。课题组前期研究发现,一个新的编码耐热核酸酶的基因nuc2和已知功能的耐热核酸酶基因nuc1同时存在于基因组中，并能表达耐热核酸酶的活性。本论文从nuc2耐热核酸酶结构和特性的比较入手，围绕新的耐热核酸酶nuc2基因的功能鉴定展开研究，进而以基因表达、功能鉴定、调控规律为重点比对分析金黄色葡萄球菌两种耐热核酸酶的差异，主要研究内容和结果如下： 1.采用生物信息学分析方法对金黄色葡萄球菌基因组中的nuc1、nuc2基因编码的蛋白质序列及结构进行比对，构建了不同种属间Nuc蛋白的进化树，揭示了金黄色葡萄球菌两个核酸酶在进化上的差异性。结果表明，Nuc2是一个在葡萄球菌属内进化较为保守的蛋白，而Nuc1则可能起源于其它菌属的水平转移。此外，在大肠杆菌中成功表达了两种核酸酶，对比研究了它们在体外表达时的酶活性特征，揭示了金黄色葡萄球菌Nuc2的酶学特征：最适反应温度为50℃，最适pH值为10，是一种非特异核糖核酸酶，适当浓度的Ca~(2+)、Mg~(2+)、DTT、β-mecaptoethanol、TritonX-100、Tween-20和Urea都能够提高Nuc2的酶活性，而Zn~(2+)、Mn~(2+)、EDTA和SDS则是Nuc2酶活性抑制剂。和Nuc1相比，体外表达的Nuc2酶活性较低，，且对高温和重金属离子的耐受力明显低于Nuc1，这和Nuc2蛋白结构上不稳定的推测结果相符。本实验从序列、结构到酶活性特征上很好地区分了金黄色葡萄球菌两个重要的耐热核酸酶，对新近发现的耐热核酸酶Nuc2的特征作了较为详尽的研究，为其功能应用奠定了基础。 2.采用Taqman荧光定量PCR方法比较了两个耐热核酸酶基因在转录水平上的差异。通过对金黄色葡萄球菌不同生长阶段nuc1和nuc2基因mRNA表达水平的比较分析，发现nuc1和nuc2基因在生长过程中的表达模式并不相同：nuc1基因的表达在对数后期达到最大值，和耐热核酸酶活性测定结果一致；nuc2基因则在生长初期达到最大值，到对数后期反而降低。另外，通过测定金黄色葡萄球菌双组分调节子sae的缺失突变对nuc1和nuc2基因表达的影响，结果发现，sae基因缺失显著下调nuc1基因的表达；而nuc2基因在sae缺失突变株中表达几乎不受影响。金黄色葡萄球菌临床分离株中的nuc1基因表达变化差异明显，nuc2基因的表达则相对稳定。通过研究nuc1和nuc2基因在表达上的相关性，发现nuc1和nuc2基因受到不同的调控机制调控，且nuc1基因的表达是决定耐热核酸酶活性表型的主要因素。 3.利用微生物的同源重组双交换的遗传原理，成功构建了耐热核酸酶nuc2基因单缺失突变株和nuc1、nuc2基因双缺失突变株，并在分子水平进行了验证。突变株耐热核酸酶活性的测定结果表明，nuc2基因缺失后，酶活性比野生型降低，双突变株则检测不到耐热核酸酶活性。构建互补载体转化双突变株,互补菌株的酶活性测定结果发现，nuc1基因互补双缺失突变株能使其完全恢复到野生型的酶活水平，nuc2基因的互补只能恢复菌株nuc1基因突变后Nuc2的酶活表型。基因突变和互补实验确定了nuc2基因在金黄色葡萄球菌中具备耐热核酸酶活性表达功能，也进一步证实了nuc1基因在耐热核酸酶活性表型中占有主导地位的结论。 4.利用基因表达谱芯片技术研究了两种核酸酶基因突变后对金黄色葡萄球菌RN4220转录组的影响，采用连锁转录及基因代谢途径定位的新分析方法，对两种核酸酶基因突变所影响的差异基因进行分析，结果表明，nuc1基因缺失显著影响了393个基因转录水平的变化，而nuc2的缺失显著影响了89个基因转录水平的变化。虽然两组基因都涉及到菌株的氨基酸代谢、糖代谢、复制修复、核酸代谢及调控因子，但在相同位置发生差异变化的基因只有20个，且调控水平都不相同。挑选21个差异基因，采用荧光定量PCR验证了芯片结果的可靠性。值得注意的是，△nuc2缺失突变株和精氨酸脱亚胺酶途径相关的基因座均下调，和ABC转运子相关的基因座上调，连锁调控的代谢途径还涉及到嘌呤代谢、甘氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等氨基酸代谢途径。△nuc1基因缺失主要下调了和磷酸转移酶系统、脂代谢及毒力调控因子的连锁基因的表达，上调了尿素酶基因及蛋白酶基因。△nuc1和△nuc2缺失突变株在转录水平分别调控了不同的基因表达，且各有分工。 5.为了更全面了解两种核酸酶基因的突变对于细胞代谢功能的影响，利用高通量的表型分析新技术--表型芯片(PM)研究了金黄色葡萄球菌两种耐热核酸酶突变株和亲本菌株RN4220的1100多种不同的表型，包括各种碳源、氮源、磷源、硫源的利用，对氨基酸及其他营养物质的代谢、渗透特征、pH及抗生素敏感性测试。和金葡亲本株相比，Δnuc2突变株的PM结果有13种表型减弱了1.5倍以上，包括对3种碳、硫源的利用，对7种氮源的利用，涉及氨基酸短肽及氨的代谢。突变株全部下调的表型说明了nuc2基因对金黄色葡萄球菌细胞的生理代谢的正常进行起着重要的作用； Δnuc1突变株的差异表型有9个，涉及氮源和磷源的代谢以及6个在酸性pH下的表型变化，和nuc2突变株表型不同的是，Δnuc1突变株中7种表型变化都是增强的，尤其是在酸性pH时突变株的生长和对氨基酸的利用上。25种抗生素敏感性测定结果发现，Δnuc2突变株和Δnuc1突变株对2-4种头孢类抗生素的抗性有所增加，这可能与膜蛋白的表达差异相关。生长曲线的测定结果表明，在酸性pH5条件下Δnuc1突变株的生长的明显高于Δnuc2菌株和野生型，且菌膜形成量明显增多，这与Δnuc1突变株在酸性条件下代谢表型的增强有重要的联系。总之，本论文揭示了耐热核酸酶基因nuc2的特征及功能，对两个耐热核酸酶在金黄色葡萄球菌中表达调控机制进行了探索，为更好地了解金黄色葡萄球菌耐热核酸酶的作用机制具有重要意义。
【图文】：

系统分类,核酸酶

上海交通大学博士学位论文与功能的作用还知之甚少，仅对于少数一些重要的核酸酶的一级结构活性位点，同源性分析和催化机制有比较详尽的研究，如对金黄色葡萄球菌核酸酶(Staphylococcal nuclease)[67, 68]，粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) 核酸酶[69]，从米曲霉（Aspergillus oryzae）分离的 S1核酸酶[70]，从柑桔青霉（Penicillium citrinum）中分离的 P1 核酸酶[71]和从埃氏交替单胞菌（Alteromonas espejiana）中分离的BAL31 核酸酶[72]。

限制性图谱,质粒,基因序列

表达重组载体所用的菌株；（2）质粒 pET-28a 购自 Novagen 公司 (Madison, WI, USA)，质粒的限制性图谱如图2-1，重组质粒载体 pET-28a-nuc1、pET-28a-nuc2 分别包含金葡基因组中 nuc1 基因序列（SA0746）(696 bp) 和 nuc2基因序列（SA1160）(656 bp)，为本实验室已保存载体[113]。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.11;R3411

【参考文献】