ASB-8基因的克隆及其生物学功能研究

发布时间：2020-05-07 23:30

【摘要】： ASB-8（human ankyrin repeat and SOCS box containing protein-8，ASB-8）是本实验室在筛选肿瘤相关基因过程中，获得的一个新的具有锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats）和抑制细胞因子信号盒（Suppressor of cytokine signaling box，SOCS box） 的蛋白家族成员。 通过5(和3( RACE的方法获得了该基因全长cDNA序列。序列分析表明，ASB-8含2,545 bp, 有完整的3'端和5'端，起始密码子前同一编码框内有终止密码子，poly A 前有加尾信号AATAAA。ASB-8的开放阅读框含864bp，编码288个氨基酸，预计分子量为31kD。经过网上生物信息库的同源比较，发现该基因编码的蛋白和小鼠ASB-8在全序列水平上有96%的同源。利用RH（Radiation Hybrid）染色体定位方法把ASB-8定位在染色体12q13区段。ASB-8蛋白的结构特点，近氨基端含一锚蛋白重复序列，由4个重复单元组成，长度为131个氨基酸残基；羧基末端存在一长度为42个氨基酸残基的SOCS盒。 Northern杂交显示该基因的组织表达谱表明，在人的心、脑、胎盘、肝脏、骨骼肌和胰腺中均可检测到一条大小约2.6kb转录本，其中在骨骼肌中表达最高，而肺组织中不表达。RT-PCR结果显示该基因在多种肿瘤细胞系中呈较高水平的表达。利用ASB-8-EGFPN1转染BEL-7402细胞进行亚细胞定位，该基因蛋白定位于细胞质中。由于ASB-8 SOCS盒中特定氨基酸残基位点并不保守，我们利用in vitro结合实验和in vivo 免疫共沉淀观察了ASB-8、缺失SOCS盒ASB-8突变体（1-235aa）、突变体M1 [249 (Thr?Asn) 和250 (Leu?Pro)] 与Elongin C和Elongin B的相互作用，，证实ASB-8基因可与Elongin B 和Elongin C结合，并且这一过程依赖于SOCS 盒的存在，第249位T和250位L的突变阻断ASB-8与ElonginB C复合物的相互作用；提示ASB-8 基因可能参与对未知特定靶蛋白的降解。 经免疫组化检测，ASB-8在肺癌组织的表达高于相应的癌旁组织。为了观察 ASB-8对肺癌细胞生长的可能的调节作用， 我们以SPC-A1细胞系为研究对象，观 WP=6 察过表达ASB-8 基因及其突变体对该细胞生长可能的调节作用；体外克隆形成试验结果显示，缺失SOCS 盒的ASB-8突变体（ASB-8(SB）对该细胞系有近53%的抑制率，而全长ASB-8对肺癌细胞的生长没有影响。同时，我们将转染上述表达载体的细胞经过G418筛选后，进一步通过体内外实验观察表位表达ASB-8 基因及其突变体对肺癌细胞系的影响，结果表明：转染ASB-8(SB的SPC-A1肺癌细胞的增殖速度显著慢于对照组细胞(P0.01)，而转染ASB-8的细胞没有明显的生长特性改变；ASB-8 SOCS盒缺失突变体对SPC-A1细胞的体内生长及肿瘤形成有一定的抑制作用(P0.01)。提示， 缺少SOCS盒的ASB-8突变体可能以dominant negative的作用方式，干扰细胞内ASB-8蛋白的正常生理作用，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用，据此， 我们认为ASB-8可能参与了肺癌细胞的生长调节，并可能与该疾病的发生和发展有着一定的关系。 为了进一步观察ASB-8在肺癌细胞生长调节中的可能机制，我们利用Atlas cDNA array分析了缺失SOCS 盒的ASB-8的突变体的表达对SPC-A1细胞的基因表达谱的影响。结果发现：该突变体的表达可以上调cAMP依赖的蛋白激酶A调节亚单位RI-(，TGF-( RIII，p38 MAP Kinase基因的表达，而这些基因可参与抑制细胞恶性转化、诱导细胞停滞、凋亡等生物学过程；同时下调Zerin，c-myc和cdc25c基因，这些基因与促进细胞周期进程和增强肿瘤细胞迁移和侵袭等活性有关。上述基因在表达上的改变可能介导缺失SOCS 盒的ASB-8突变体对SPC-A1细胞的生长抑制。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

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本文编号：2653720