CREG调控内皮细胞周期的作用机制研究及其在小鼠下肢缺血模型中的作用

发布时间：2020-05-09 10:28

【摘要】：目的：内皮损伤是动脉粥样硬化、心肌梗死、经皮冠状动脉介入治疗术后支架内再狭窄、下肢动脉硬化闭塞症（PAD）、休克等各种血栓性疾病的始动病因。促进内皮细胞（EC）的完整性，维持其正常功能，将为此类疾病提供新的防治手段。本研究探讨了一个新近发现的调控细胞转录的基因——E1A激活基因阻遏子（CREG）调控人脐静脉内皮细胞（HUVEC）周期的作用和机制，并在小鼠下肢缺血模型中初步探讨了其对血管新生的影响。方法：（1）以绿色荧光蛋白（GFP）腺病毒感染HUVEC作为对照，应用CREG腺病毒使HUVEC过表达CREG，以细胞计数、BrdU掺入实验、流式细胞术（FCM）检测CREG对HUVEC增殖的影响，Western blot检测HUVEC中CREG、信号通路、细胞周期蛋白（Cyclins）及细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的表达，RT-PCR检测Cyclins在转录水平上的表达差异。（2）以表达短发卡RNA （shRNA）序列的阴性空载体为对照，将CREG表达沉默的shRNA载体转染至逆转录病毒，产生病毒后感染HUVEC，经嘌呤霉素筛选，得到CREG表达下调的HUVEC；应用细胞计数、BrdU掺入实验、FCM检测从功能缺失角度验证CREG下调对HUVEC增殖的影响。（3）根据信号通路Western blot结果的提示，应用信号通路阻断剂阻断可被CREG明显影响的信号通路，以BrdU掺入实验及FCM检测细胞增殖并确定CREG发挥生物学作用的通路，Westernblot检测蛋白表达及信号通路蛋白及Cyclins的表达，确定CREG相关的信号通路及Cyclins。（4）在腺病毒感染造成CREG过表达的HUVEC中使用血管内皮生长因子中和抗体（VEGF NA）阻断VEGF的作用；在CREG被干扰造成其表达下调的HUVEC中添加重组人血管内皮生长因子（rhVEGF165），以细胞计数、BrdU掺入试验、FCM检测细胞增殖，同时以Western blot检测信号通路以及Cyclins的表达，确定血管内皮生长因子（VEGF）是否参与了CREG调控HUVEC增殖及Cyclins表达的作用。（5）以正常的以及感染GFP腺病毒的HUVEC作为对照，应用体外及小鼠在体matrigel血管生成实验检测HUVEC感染CERG腺病毒后对血管生成的影响；制作小鼠下肢缺血模型后，以PBS、GFP腺病毒做为对照，应用CREG腺病毒感染局部缺血肌肉组织，观测术肢体温、自体截肢率，以病理切片观测肌纤维形态改变，应用血流灌注成像仪检测术肢/健肢灌注比，检测CREG对小鼠下肢缺血的治疗作用以及对血管新生的影响。结果：（1）与对照组相比，HUVEC经腺病毒感染过表达CREG后，细胞计数增多，BrdU掺入实验中BrdU阳性细胞百分比增多，FCM分析提示S+G2期占全部细胞比例增多；而在shRNA导致CREG表达下调后，与对照组相比，发现细胞计数减少，BrdU阳性细胞百分比减少，FCM分析可见S+G2期占全部细胞比例减少。（2）Wstern blot提示：与对照组相比，CREG可使ERK、PI3K/Akt信号通路激活，Cyclin E表达增多，RT-PCR发现CREG可在转录水平影响Cyclin E的表达。（3）信号通路阻断剂添加后，BrdU掺入实验及FCM检测提示：尽管PI3K/Akt、ERK信号通路都可影响CREG调控的HUVEC增殖，但ERK通路特异性的介导了CREG对HUVEC增殖的调控，，Western blot检测也证实了ERK特异性的介导了CREG对Cyclin E的调控。（4）体外及在体matrigel血管生成实验发现CREG过表达可使毛细血管密度明显增多；小鼠下肢缺血模型制作成功后，以腺病毒感染缺血区肌肉组织，经检测发现过表达CREG的腺病毒感染组与PBS组以及GFP腺病毒相比，术肢体温升高、自体截肢率降低、病理切片提示肌纤维萎缩程度明显减轻，血流灌注成像仪检测结果提示与对照组相比，CREG过表达组术肢/健肢灌注比升高。结论：（1）CREG可促进体外培养HUVEC的增殖；（2）ERK/Cyclin E通路介导了CREG对HUVEC增殖的调控作用；（3）CREG过表达能促进小鼠缺血下肢的血管新生。本研究为PAD的治疗提供了一个新的靶点，也为CREG在缺血性心肌病、经皮冠脉内介入治疗术后支架内再狭窄及迟发性血栓的防治中的应用提供了新的证据。
【图文】：

腺病毒感染,效率,细胞,感染率

组以及 HUVEC 组相比有 CREG 表达明显增多，而对照组（HUVEC-GFP 组）与正常组（HUVEC 组）相比无明显差异（图 2-1B）。图2-1 腺病毒感染HUVEC的效率以及Western blot检测CREG表达情况A. HUVEC-AdCREG组以及HUVEC-GFP组经相应腺病毒感染72h后感染率均在90%以上。a.光镜下HUVEC-AdGFP组细胞图像；b.荧光显微镜下HUVEC-AdGFP组细胞发出荧光，感染率90%以上；c.光镜下HUVEC-AdCREG组细胞图像；d.荧光显微镜下HUVEC-AdCREG组细胞发出荧光，感染率90%以上。B. Western blot检测各组细胞CREG表达情况。上图：Western blot 提示HUVEC-AdCREG组细胞CREG表达明显增多；下图：灰度半定量分析（以β-tubulin作为内参，CREG/β-tubulin灰度比作为数值进行比较）提示HUVEC组（0.62±0.04）与HUVEC-AdGFP组（0.58±0.06）之间CREG的表达差异无统计学意义（NS: no significance），HUVEC-AdCREG组（3.60±0.37）与HUVEC、HUVEC-AdGFP间相比差异具有统计学意义（**p＜0.01, n=3）。2）CREG过表达可促进原代培养的HUVEC的增殖。HUVEC经CREG腺病毒感染后，经细胞计数、BrdU掺入试验及FCM检测分析，与正常HUVEC及HUVEC-AdGFP对照组相比，HUVEC-AdCREG组在培养第3d细胞数量明显增多（162.7±10.5×105vs 130.7±6.7×105vs 135.7±6.0×105

过表达,细胞计数,统计学意义,百分比

第三军医大学博士学位论文25胞比例显著增高（64.3±5.1% vs 49.3±5.1% vs 51.7±6.8%，图2-2B）、S+G2期细胞百分比显著增高（65.0±2.6% vs 43.3±1.5% vs 44.0±1.0%，图2-2C），差异具有统计学意义，HUVEC组与HUVEC-AdGFP组相比无统计学意义。这些结果表明CREG过表达可促进HUVEC的增殖。图2-2 细胞计数、BrdU掺入实验、FCM分析检测CREG过表达对HUVEC增殖的影响A．细胞计数：三组细胞各取2×105连续培养72h，每24h计数，结果经统计学分析提示：HUVEC-AdCREG组（162.7±10.5×105）与HUVEC（130.7±6.7×105）、HUVEC-AdGFP（135.7±6.0×105）组相比，生长至72h时计数结果差异具有统计学意义（** p＜0.01, n=3），HUVEC与HUVEC-AdGFP组相比差异无统计学意义。B．BrdU掺入试验：结果提示BrdU阳性细胞百分比在HUVEC-AdCREG组（64.3±5.1%）与HUVEC组（49.3±5.1%）、HUVEC-AdGFP（51.7±6.8%）组相比差异具有统计学意义（* p＜0.05,n=3 ），HUVEC与HUVEC-AdGFP组相比差异无统计学意义（NS: no significance）。C．FCM检测：HUVEC-AdCREG组S+G2期细胞百分比（65.0±2.6%）与HUVEC（43.3±1.5%）、HUVEC-AdGFP（44.0±1.0%）组相比差异具有统计学意义（*** p＜0.001, n=3）
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R54;R-332

【参考文献】