NHL石蜡包埋组织免疫球蛋白基因重排PCR检测条件的优化

发布时间：2020-05-15 08:01

【摘要】： 一、研究背景和目的淋巴瘤病理学诊断是临床病理诊断工作中的主要难题之一，迫切需要其它技术来协助，如免疫组化技术和基因重排检测技术等。自McCarthy将PCR技术用于检测抗原受体基因重排辅助诊断淋巴瘤以来，一直受到人们的关注。然而，假阴性率高、结果不稳定等因素严重阻碍着该技术的广泛应用，在石蜡组织中尤其如此。随着分子生物技术的发展和人类基因组测序工作的完成，将该技术进一步完善并及早运用于临床已势在必行。出于此目的，本研究以石蜡组织为主要研究对象，从免疫球蛋白(Ig)基因重排引物分析和设计、引物条件的摸索、石蜡包埋组织DNA的提取、引物在淋巴瘤石蜡组织中的重排测定比较等诸方面，对Ig基因重排PCR检测的条件进行了优化和探索。二、方法 1．①用Clustal W软件，将常用的15余对用于Ig重链和轻链基因重排检测的引物与免疫球蛋白基因组中相应区域基因片段进行比较和分析。②用Primer Premier5.0软件对引物结构进行了分析和优化。 2．①通过检测DG75和Jurkat淋巴瘤细胞的基因重排，将15对引物的条件进行优化和选择。②对PCR重排产物进行了测序和分析。 3．用21例淋巴相关石蜡组织，通过测定DNA含量和观察PCR结果等方法，比较了消化法、酚抽提法和试剂盒法对石蜡组织DNA提取效果。第一军医大学齐宗利 4.用8对(I 97对和TC助1对)基因重排引物，对144例(B淋巴瘤 113例、T淋巴瘤24例、淋巴结反应性增生7例)石蜡组织的基因重排进行了检测。三、结果 1.①通过比较巧对引物，设计出4对新的Ig基因重排引物(P2、 PZB、P、和P劝。②Primer Pre而er软件结果认为结构较为合理。 2.①优化筛选出s对(197对和TCRI对)引物。②用IgH FR3区基因重排引物测定DG75细胞基因重排，可扩增出3条清晰条带，经测序证实，第一条带为目的带，其它两条均与免疫球蛋白序列有关:③已经向GeneBank递交了5个基因序列，最早递交的P3一SFA (v26一oL4一1 14bp)己经公布，其它序列正在处理之中。 3.①从模板oD26夕OD28。比值和稳定程度上看，试剂盒法提取的 DNA质量要略优于酚抽提法和消化法;②从用PcR扩增看家p一globin 基因片段的结果来看，这几种方法差别不大。 4.①在49例B细胞淋巴瘤石蜡组织中，引物对Pl(F R3区引物)、 PZA(FR2区引物)、Plc(F Rl区引物)的检出率分别为71.4%、61.2%和 36.70，0，Ple检出率明显低于PI和 PZA。②rR3区的引物对(P一、PZ、P3) 对113例B细胞淋巴瘤的阳性检出率分别为71.7%、82.3%、76.1%，三者之间检出率无统计学差异，其中，我们自己设计的引物对P2检出率最高。③Ig轻链的引物(PK+P劝在39例B细胞淋巴瘤的检出率为71.8%， ④经测定结果的分析、组合和比较，优选出一对最佳引物对一(P1+P2)，使B细胞淋巴瘤石蜡组织重排的检出率由82.3%提高到92.9%。四、结论本研究设从引物分析入手，设计出4对用于免疫球蛋白基因重排的引物(重链为P2和PZB，轻链为PK和P劝。通过淋巴瘤细胞和石蜡组织基因重排的检测，得出如下有意义的结论: 1.石蜡组织基因重排检测中，IgH不同框架区的引物检出率明显不同，IgH FR3区引物明显高于FRI区和FRZ区引物。 2.与其它常用引物相比，我们新设计的IgH FR3区引物对(pZ)在1 13 一2- 博士研究生学位论文例B细胞淋巴瘤检出率最高，，为82.3%。 3.(P1+P2)引物的组合，可使B细胞淋巴瘤石蜡组织基因重排的检出率提高到92.9%。 4.在石蜡组织DNA的提取方法中，消化法安全、简单、实用，只要DNA浓度适量，可以取得与其它石蜡包埋组织DNA提取方法同样的效果。
【图文】：

琼脂糖电泳,对重,引物,退火温度

犯O乃O，125众的黔图2一2引物浓度对基因重排影响的2%琼脂糖电泳结果(单位:mM)三、IgH重排引物对DG75细胞重排温度梯度检测的结果进行温度梯度PCR时，首先按照表2一1中的程序进行，如果只有某一侧部出现条带(左侧或右侧)，可根据情况，适当对预设的退火温度进行调整。各引物的最佳退火温度见表2一2。表2一219重链重排引物的最适退火温度PrimerforIgHannealingT(aC)Band(bp)Ple(FRle一JH18)61.0330一350PZA(FRZA一川18)59.0250一270PZB(FRZB一爪18)60.0250一270PI(FR3一川)58.080一120PZ(FR33一爪3)61.080一120P3(V26一OL4)58.080一120一41-

基因重排,引物,琼脂糖电泳,浓度

博士研究生学位论文缺12.的存自的3，佣1501，13众书03名众的图2一1不同Mg2+浓度对重排检测影响的2%琼脂糖电泳结果(单位:卿)(注:M为100一600饰ladderMarker，以下同)二、引物浓度对基因重排结果的影响以FR3一m为引物，DG75为模板进行PCR反应，结果引物浓度在0.2一0.SInM之间最佳。带丫粤势参爪拼.性一0，犯O乃O，125众的黔图2一2引物浓度对基因重排影响的2%琼脂糖电泳结果(单位:mM)三、IgH重排引物对DG75细胞重排温度梯度检测的结果进行温度梯度PCR时，首先按照表2一1中的程序进行，如果只有某一侧部出现条带(左侧或右侧)
【学位授予单位】：中国人民解放军第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R361

【参考文献】