人REV3基因在MNNG诱发的非定标突变中的作用及其转录水平调控的分子机理研究

发布时间：2020-05-20 01:36

【摘要】： 化学致癌物可以引起DNA损伤或非DNA损伤效应(外遗传效应)，前者如果没有被正确修复，则有可能通过跨损伤合成途径形成定标突变。非定标突变是指发生在非损伤DNA部位的突变，有可能被DNA损伤或非DNA损伤效应所诱发。当暴露于环境因子时(比如紫外线辐射)，大肠杆菌会激活SOS反应，，从而产生损伤耐受，但其后果之一是引起非定标突变，而DNA聚合酶Ⅳ、Ⅴ均参与了SOS诱发的非定标突变。DNA聚合酶Ⅳ主要引起非定标-1移码突变，DNA聚合酶Ⅴ则需要RecA*蛋白与SSB的协同，引起的非定标突变的突变谱以颠换为主(占53％)。单核苷酸置换与一个碱基缺失的比例为1:2。但是，真核生物中非定标突变的发生机制还不清楚。我们实验室近年的工作对哺乳细胞非定标突变机制的研究初步表明，细胞在受低剂量MNNG攻击后的早期，首先发生外遗传的改变，包括45KD与62KD蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高、JNK／SAPK通路的激活、cAMP-PKA-CREB通路的激活以及NF-κB的激活。同时在产生非定标突变的细胞中检测到基因表达的改变，进一步研究发现细胞受MNNG攻击后DNA复制保真度下降、DNA聚合酶酶谱发生改变。因此，我们推测，哺乳细胞中低保真度的跨损伤DNA聚合酶可能参与了MNNG诱导的哺乳细胞非定标突变。初步认为，MNNG诱发非定标突变的形成是继有关细胞信号转导通路激活后，导致相关基因表达的改变，并引起DNA聚合酶酶谱表达的改变，最终使DNA复制保真度下降，从而使突变发生在未损伤的DNA模板上。但是，哺乳细胞中是哪种跨损伤DNA聚合酶参与了非定标突变还不是很清楚。本实验对人DNA聚合酶＜催化亚基的编码基因REV3在非定标突变形成中的作用及其转录水平的调控机制进行了研究。结果表明，低剂量MN’NG攻击人羊膜上皮培养细胞（FL）会引起REV3 基因转录水平的表达上调，并具有时相性变化，其表达水平分别在MNNG 处理后1二小时与24小时较对照提高1．刀倍与1石5倍O＜0刀匀。这种表达变化与我们实验室发现的MN’NG诱发的非定标突变形成的时相是基本一致的。进一步的非定标突变分析显示，REV3基因功能被反义阻断的细胞具有极显著的抗非定标突变的作用。在REV3基因被反义阻断的 FL－REV3”细胞中，pG诱发的非定标突变频率极显著地从27．4 X10”4 下降到4刀X10－4印＜0刀1人恢复到自发突变的水平。WesteX印迹证实了FLREV3细胞中REV3基因功能得到了有效的反义阻断。从而首次证实，DNA聚合酶二参与了哺乳细胞非定标突变的形成。如前所述，低剂量MNNG会引起哺乳细胞早期的某些外遗传改变，激活转录因子CREB、AP－l以及NF－h。本实验中的生物信息学分析显示，人REV3基因启动子区域存在上述转录因子的结合位点。因此，我们推测，MN’NG引起的有些转录因子的激活导致REV3基因转录水平的表达上调。而REV3基因的激活，导致人DNA聚合酶二参与非定标突变的形成。本实验结合计算机染色体步移技术、报告基因以及瞬时转染分析，首次克隆了人REV3基因启动子，并研究了其对MN’NG的反应。结果表明，在细胞受到MNNO攻击后24小时，与基础表达相比，REV3基因的 3 启动子强度极显著地增强了。进一步的REV3基因启动子缺失体分析结果表明，REV3基因启动子对MN’NG的反应元件区域存在于位于REV3基因上游－404～102核昔酸之间upGL3卫582重组子的20if位与2314位 Sma酶切位点之（e），而仅含有单独的CREB元件还不足以激活REV3 基因的表达，需要数个转录因子的共同调控。综合上述研究表明，在MNNG诱发的哺乳细胞非定标突变形成过程中，早期的外遗传改变可以最终激活人DNA聚合酶＜的催化亚基编码基因REV3的表达，从而募集低保真度的DNA聚合酶二参与形成非定标突变。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346

【共引文献】