多表位融合HCV抗原的构建与双抗原夹心检测anti-HCV可行性研究

发布时间：2020-05-20 10:58

【摘要】：研究目的：anti-HCV检测对于控制HCV经输血传播，及时诊断HCV感染患者发挥了巨大的作用。目前所用第三代ELISA检测试剂较早期试剂在灵敏度和特异性上都有了很大提高，但在检测低感染率(＜10％)人群时特异性仍不理想，阳性结果人群中约35％(15％－60％)为假阳性，在献血员中阳性结果的预示值仅为70－80％，造成了医疗资源和宝贵血源的很大浪费。双抗原夹心法在方法学上比目前所用间接法特异性更好，灵敏度更高，本研究旨在建立双抗原夹心anti－HCV ELISA检测方法，以解决间接法特异性不足问题。 研究内容： 1．多表位融合重组HCV抗原基因的克隆与序列分析 选择HCV结构蛋白和非结构蛋白优势抗原表位的编码基因，以及来自HCV不同病毒型别的抗原表位编码基因共12个，拼接成长度为1450bp的嵌合抗原编码序列，插入pQE-30和pinpoint T表达载体，分别转入M15和JM109(DE3)工程菌，应用PCR扩增和测序证实插入序列具有正确的编码序列和正确阅读框架。 2．多表位融合重组HCV抗原的表达、纯化与活性鉴定 将M15和／M109(DE3)工程菌诱导表达显示，融合蛋白在M15中以包涵体形式表达，带有6×组氨酸标签；在JM109中可溶性表达，氨基端带有生物素化的标签。表达蛋白经亲和纯化后分别测定各抗原表位的分片段抗原性和生物素标签的亲和素结合活性。结果表明重组蛋白抗原性完整，可以用于anti-HCV的检测；生物素标签具有良好的亲和素结合活性，可用作ELISA检测的信号放大系统。 博士学位论文:多表位触合HCV抗原的构建与双抗原夹心检测anti一HCV可行性研究 3.Anti一HCv双抗原夹心EL工SA法的建立及效果评价 用His一tagged一HCV抗原包被酶联板，以可溶性表达的biotin一tagged一HCV作 为夹心抗原，Str即tav 1 d in一HRP用作显色用酶标记物建立了双抗原夹心法。 结果显示，方法具有极好的特异性，400份阴性血清无一例假阳性; 接法检测阳性的标本中，有12份标本双抗原夹心法检测阴性，这 RT一PCR及RIBA确证试验均为阴性。 结论:目前anti一HCV的检测国内外均只有间接ELISA法，本文选取 临床350 应用 份间 12份标本经 优势表位和不同型别抗原表位， 抗原去除了与检测无关的序列， 构建了多表位融合重组HCv抗原。 HCV各抗原的 优势表位融合 避免了非特异反应的发生;同时由于兼顾了不同 HCV型别差异，也会使检出率有所提高。带有生物素标签的融合抗原克服了分片段 抗原联合应用时难以掌握配比及酶标记对抗原活性影响等难题，使双抗原夹心检 测anti一HCV得以实现。本研究所建立的双抗原夹心ELISA检测法的特异性远高于 目前广泛使用的间接法，双抗原夹心法能同时检测IgG、IgM和工gA抗体，提高了 检出率，应用Biotin--avidin这一成熟稳定的信号放大系统提高了方法灵敏度。如 用于anti一HCV筛查，可以显著降低宝贵血源的浪费，并减少临床误诊率，节约医 疗资源:并有可能代替昂贵复杂的RIBA，成为简便易行的anti一HCV确证试验。
【图文】：

博士学位论文:多表位融合HCv抗原的构建与双抗原夹心检测anti一HCv可行性HCV也是诊断丙型肝炎患者的有效手段。最初仅使用单一的克隆表达HC蛋白C一100包被酶联板检测相应的抗体，该方法存在的问题是:①抗一C100较晚，直到肝炎发生15周后才能检出NS4抗体。②灵敏度不高，少数病到针对非结构区抗原C一100的抗体，会造成一定数量的漏检。③特异性差自身免疫性慢性肝炎患者可出现假阳性，因而阳性结果需要重组免疫印迹ReeombinantxmmunoboltAssay，班BA)证实[3]。第二代EIA试剂引入了组抗原，包括C22一3(Core)，C33e(N53)，C100一3伽54)。第三代又增加了N，多种抗原的同时应用提高了检测的敏感性。随着EIA试剂的改进，检测不断缩短，l，2，3代检测试剂窗口期分别为16、10、7一8周，灵敏度的提益于对核心和NS3的改造，NSS抗原的应用对灵敏度无明显影响〔j·污，。一、EUSA检测试剂所用抗原区别如图2所示:

经文献调研和DNAstar等生物学软件分析，选择分布于HCV各抗原的优势表位编码序列共12个，，分别来自于Core、EZ、NS3、NS4和NSS，它们在HCV多蛋白前体上的位置如图1.1所示。图1.1所选优势抗原表位与HCV多蛋白前体的对应关系考虑到HCV中国流行株与国外的差异，为使融合抗原更能代表HCV国内感染株的实际情况，避免因直接简单采用国外报道序列所引起的因序列差异而产生漏检，本研究针对性地选择Genebank中的D10934、L02836和D00944的序列，分别分离自北京、河北和日本病人[’，2l。序列的来源及其在嵌合抗原上的位置如图1.2所示。D10934序列的7224一7280bP7513一754lbPD00944序列的6112一6182bPL02836.1的5341一558IbPLLL02836.l的的444045一4269bPPP444416一4710bPPPL02836.1的1744一1847bP1981一2046bP2077一Z139bPD10934序列的654一695bP341一458bPD00944序列的530一580bP图1
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【共引文献】

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1 李保昌,孙萍,杨淑华,王全立;生物素化HCV多抗原表位融合基因的克隆及可溶性表达[J];中国实验血液学杂志;2004年03期

本文编号：2672516