TL1A促进活性氧生成介导高糖所致血管内皮细胞凋亡

发布时间：2020-05-20 22:02

【摘要】：研究背景高糖诱导内皮细胞凋亡是糖尿病血管病变的重要环节,但其机制尚未阐明,普遍认为,高糖诱导内皮细胞凋亡与活性氧(ROS)生成过量、清除减少,导致氧化应激有关。我们最近的工作得出,高糖条件下,人脐静脉内皮细胞TL1A表达明显增多。TL1A作为一种新近发现的促进内皮细胞凋亡的细胞因子,是否通过ROS诱导细胞凋亡,目前国内外未见相关报道。 目的观察TL1A对人脐静脉内皮细胞活性氧生成的影响,探讨TL1A在高糖诱导细胞凋亡中的作用及其机制。 方法1.以不同浓度(5.6mM,11.2 mM, 22.4 mM,33.6 mM)葡萄糖孵育人脐静脉内皮细胞24h,或以22.4 mM葡萄糖培养人脐静脉内皮细胞不同时间(0h, 6h, 12h, 24h, 48h),Western bloting检测各组内皮细胞TL1A蛋白的表达。2.将孵育的人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、正常糖+TL1A组、高糖对照组、高糖+SOD+CAT组、高糖+TL1A抗体1μg/ml组、高糖+TL1A抗体3μg/ml组、高糖+TL1A抗体9μg/ml组和高渗对照组。DCFH-DA染色法观察活性氧生成较多的细胞数,并采用流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞ROS生成量; Annexin V/PI荧光双染色、流式细胞仪检测细胞凋亡率;酶标法检测caspase-3的活性。 结果高糖条件下,人脐静脉内皮细胞TL1A蛋白表达显著增高(P0.01),且呈时间和浓度依赖性。与正常对照组相比,高糖组人脐静脉内皮细胞ROS生成量明显增加,76.96±6.61vs 46.80±4.10(P0.01),正常糖+TL1A组ROS生成量达93.75±9.12,为正常对照组的2倍,也显著高于高糖对照组(P0.01),高糖培养液中加入TL1A抗体,ROS生成量呈剂量依赖性减少,高糖+TL1A抗体9μg/ml组内皮细胞ROS生成量与高糖+SOD+CAT组和正常对照组相近;染色法检测HUVECs活性氧生成较多的细胞数结果与前述变化趋势一致。正常对照组细胞凋亡率为4.09%±0.39%,高糖对照组细胞凋亡率为23.70%±3.20%(P0.01);正常糖+TL1A组细胞凋亡率达正常对照组的8.6倍,为高糖对照组的1.5倍(P0.01);TL1A抗体呈剂量依赖性减少血管内皮细胞凋亡率,其中高糖+TL1A抗体9μg/ml组细胞凋亡率与高糖+SOD+CAT组和正常对照组相近;高渗透压不引起细胞凋亡。Caspase-3活性变化趋势与细胞凋亡率变化结果相近。 结论高糖上调人脐静脉内皮细胞TL1A的表达,TL1A增加血管内皮细胞活性氧生成介导高糖所致的血管内皮细胞凋亡。
【图文】：

实 验 结 果1.高糖条件下人脐静脉内皮细胞TL1A的表达1.1不同浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞TL1A表达的影响分别以5.6mM、11.2 mM、22.4 mM和33.6 mM葡萄糖培养人脐静脉内皮细24h, 以5.6 mM葡萄糖+28 mM甘露醇作为高渗透压对照，Western bloting检测脐静脉内皮细胞TL1A蛋白的表达，结果见图1。用11.2 mM、22.4 mM和33.6 m葡萄糖培养人脐静脉内皮细胞24h，内皮细胞TL1A的表达显著高于5.6mM葡萄培养的对照组（P＜0.01），其中22.4 mM葡萄糖培养的人脐静脉内皮细胞TL表达最高。说明高糖上调人脐静脉内皮细胞TL1A表达。高渗对照的人脐静脉皮细胞TL1A表达也有所增多，但与对照相比，不具统计学差异。

图2.22.4mM葡萄糖培养HUVEC不同时间TL1A蛋白的表达（n=3）* P＜0.01，与0h比较2. TL1A对高糖所致HUVECs ROS生成的影响2.1 DCFH-DA染色法检测HUVECs活性氧生成较多的细胞数以5.6mM葡萄糖孵育人脐静脉内皮细胞24h，显示红染的细胞数少；于5.6mM葡萄糖孵育人脐静脉内皮细胞加入50ng/ml TL1A，红染的细胞数量显著增多，说明TL1A能促进内皮细胞活性氧生成增多；以22.4mM葡萄糖孵育人脐静脉内皮细胞24h，红染的细胞数也显著多于正常对照组，表明高糖显著增加内皮细胞活性氧生成；于高糖培养液中加入超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（CAT），红染的细胞数较高糖对照组显著减少，略多于正常对照组；而于高糖培养液中分别加入TL1A单克隆抗体1μg/ml, 3μg/ml, 9μg/ml，红染的细胞数呈浓度依赖性减少，当TL1A单克隆抗体浓度增至9μg/ml时，，可见红染的细胞数量显
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R363

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本文编号：2673260