FGFR3在骨骼发育、稳态维持中的作用与相关机制研究

发布时间：2020-05-27 07:56

【摘要】：FGFR3基因编码区的功能增强型(Gain-of-function)点突变可引起多种人类骨骼遗传病，包括人类非致死性侏儒最常见的类型--软骨发育不全、致死性软骨发育不全等。这些软骨发育不良性疾病主要影响经软骨内成骨过程形成的长骨。除部分患者除可通过外科手术进行部分延长肢体外，目前尚无有效的治疗方法。 FGFR3是软骨发育的负性调节分子，影响软骨细胞的增殖活性和分化。Chen等发现，FGFR3信号通过STAT1/p21抑制软骨细胞增殖，通过Ihh抑制软骨细胞分化。表达FGFR3ACH(FGFR3G380R)和TDII(FGFR3K650E)突变可导致ATDC5细胞凋亡增加，，而给予PTHrP处理后这种凋亡增加可缓解。PTH1-34抑制FGFR3突变所致的凋亡增加，增加突变所致的生长受抑。PTH1-34能否在体水平上缓解FGFR3功能增强所引起的软骨发育不全及其可能的作用机制有待于研究。 FGFR3除影响骨骼发育外，还参与椎间盘稳态维持。鉴于其在关节软骨中促合成代谢，保护软骨基质免于降低的作用及终板、关节软骨组成的相似性，我们提出FGFR3可能参与软骨终板稳态维持，并通过模式小鼠进行研究。 骨骼遗传疾病致病基因的发现不仅有利于相关遗传病与基因功能的研究，还极大地促进了对骨骼细胞发育分化调控机制的认识。短指是常见的骨骼发育不良性疾病，目前尚有较多导致短指的基因尚未克隆。我们通过细胞转染结合报道基因活性检测，初步鉴定了一种以E型短指、身材矮小为主要表型的骨骼发育不良性疾病的突变基因的功能。 研究方法： 第一部分： 1．给药方式：出生当日的WT及ACH小鼠，分别随机分为给药组与对照组，给药组给予100μg/(kg·d) PTH1-34皮下注射Fgfr3+/K644Eneo与EIIa-Cre交配，于怀孕E13.5天开始给予100μg/(kg·d) PTH1-34皮下注射至小鼠生产，对照组均给予等量注射用水直至观察期结束； 2．统计小鼠存活情况，测定小鼠生长过程中体重、体长等的变化，采用X线摄影、μCT头颅局部摄影，观察小鼠大体形态及颅底软骨连接的变化情况； 3．通过HE染色观察次级骨化中心等生长板发育情况，μCT观察小鼠成年期骨结构； 4．采用PTH1-34间断处理培养的WT及ACH小鼠胚胎骨组织，观测其对培养骨组织生长的影响； 5． PTH处理培养的肢芽Micromass细胞，观察其软骨小结形成及基质分泌； 6．利用前软骨细胞及293T细胞转染不同形式的FGFR3，研究PTH处理对相关分子表达及活性的影响。 第二部分： 1.建立软骨中敲除FGFR3小鼠及成年期软骨中敲除FGFR3的小鼠模型； 2.利用X线、μCT及组织切片阿尔新蓝-苏木素-伊红染色观察椎间盘； 3.免疫组化检测小鼠椎间盘软骨细胞基质Col2、Col10，软骨基质酶类MMP13、ADMTS，成骨标志OC及血管标记VEGF、CD31表达； 4.定量检测椎间盘组织中相关基因Col2、Col10、Aggrecan、OC、MMP13、ADMTS的表达变化。 第三部分： 1.通过前软骨细胞ATDC5转染不同形式的X，MTT及细胞计数检测细胞增殖，阿尔新蓝染色基质分泌，定量检测Col2、Col10、Aggrecan、PTHrP及FGFR3等软骨分化相关基因表达； 2.构建Pthlh不同长度报道基因，利用双荧光素酶基因报告系统研究突变X对Pthlh转录活性的影响。 实验结果： 一、PTH1-34可治疗FGFR3功能增强的软骨发育不良 1. PTH处理可使TDII小鼠存活，但存活的TDII小鼠仍然存在骨骼发育障碍：个体短小、骨骼短缩弯曲、生长板结构紊乱、颅底软骨连接提前闭合、骨小梁减少等； 2. PTH处理促进ACH小鼠大体生长，缓解其头颅圆钝，促进其次级骨化中心出现，以及改善其成年期骨量减少； 3. PTH可促进培养骨组织生长，并主要通过促进软骨生长发挥作用； 4. PTH可促进ACH小鼠肢芽Micromass软骨小结形成及基质分泌； 5. PTH对ACH软骨的影响可能通过降低FGFR3的表达及活性，促进PTHrP表达来完成。 二、FGFR3参与终板/椎间盘稳态维持 1. ACH小鼠终板自发性退变----骨化较WT小鼠延迟； 2.全身及软骨内敲除FGFR3小鼠脊柱侧弯、骨量减少、椎体生长板及终板结构紊乱，椎体/椎间盘发退变较野生小鼠提前：骨赘生成； 3.成年期软骨细胞敲除FGFR3后小鼠椎间盘终板出现退变的早期表现：软骨基质丢失，终板出现类似异位成骨的骨样组织，成骨标记OC、软骨基质降解酶MMP13表达增加。 三、突变X基因抑制软骨发育及Pthlh转录活性 1.突变X基因抑制软骨增殖、基质分泌及降低软骨分化相关基因Col2、Col10、Aggrecan、PTHrP及FGFR3表达； 2.突变X可能通过pthlh基因启动子上的AP1结合位点抑制其转录活性。 结论： 一、PTH1-34可治疗FGFR3功能增强所致软骨发育不全及致死性发育不良 二、FGFR3对终板/椎间盘退变有一定的保护作用 三、突变X基因可能通过抑制软骨增殖分化、Pthlh转录活性及促进FGFR3表达导致软骨发育障碍
【图文】：

图 2-1 FGFRG369C/+小鼠(ACH)基因型鉴定原理及电泳图+/K644Eneo小鼠鉴定条带大小约为 200bp(2 号泳道)，EIIap(1、2 号泳道)，重组小鼠鉴定条带大小约 260、290bpR3-31 RINA+/K644Eneo(normal)1011约200bpR3-31 NR-36(TDII)1011约290bpLoxp*15neoK644E*15K644EEIIa-Cre1 2 1 2 1 2+/K644E

第三军医大学博士学位论文体的长度没有明显变化。表 2-3 2 月龄小鼠骨骼长度（n=4-6，单位：cm）Humerus Femur Vertebral（L1T control 1.29±0.07 1.48±0.03 1.47±0.04H-treated WT 1.30±0.02 1.50±0.04 1.47±0.04H control 1.01±0.03a1.21±0.03a1.38±0.04aH-treated ACH 1.14±0.02a,b1.34±0.05a,b1.44±0.03vsWT-,P <0.05; b :vsACH-, P<0.05
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

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