阴道上皮细胞体外诱导骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的研究

发布时间：2020-05-28 00:41

【摘要】：第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的：建立一套简单高效，重复性好的体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，为阴道组织工程的研究作准备。方法：全骨髓贴壁培养法培养MSCs。分离大鼠双侧胫、股骨，剪去两侧骨骺端，无菌条件下用DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔。获得的细胞悬液移入离心管200g，5min离心。弃上清，DMEM/F12完全培养基重悬，70μm细胞筛过滤细胞悬液，计数，调整细胞浓度为7.5×107/ml，以1.5×107个/cm~2密度铺于25cm~2细胞培养瓶中，即每瓶5ml。置细胞培养箱中培养。48小时首次半量换液，之后3-4天换液一次。待细胞70%-80%融合时使用胰蛋白酶消化传代。弃去培养液，37℃预热的PBS液冲洗约2-3次，加入0.5ml胰蛋白酶溶液，25℃消化约2min，加入DMEM/F12完全培养基终止消化。弯头吸管沿瓶底轻轻吹打，收集细胞悬液，以1×104个/cm~2的密度接种于新的培养瓶内进行扩增培养。MTT法评价第1至5代细胞增殖情况。经传代纯化后第三至五代MSCs使用流式细胞学分析CD29，CD90及CD45表达。成骨成脂诱导鉴定MSCs的多向分化能力。成骨诱导液诱导14天后，按照试剂盒说明做碱性磷酸酶（ALP）活力测定，不溶的红色颗粒沉淀指示ALP的活性位点。诱导21-28天时，用茜素红染色评价大鼠骨髓间充质干细胞的矿化能力。成脂诱导液诱导14天后油红O染色确定是否有脂滴生成。结果：原代培养7-10天左右细胞呈集落生长，逐渐融合成片，融合约70%-80%，可传代培养。传代活细胞24h完全贴壁生长。传代后细胞生长更快，三至五天后细胞即可融合，呈梭形漩涡样生长，可再次传代。传代MSCs在接种第1-2天为细胞适应期，第3-4天进入对数生长期。第5天后曲线逐渐变得平缓，细胞增殖明显减慢，进入平台期。MSCs经流式细胞分析高表达CD29，CD90，阳性率分别为99.91%、99.95%；而CD45呈阴性，阳性率为0.03%。成骨分化诱导2周后ALP活性增高，4周后茜素红矿化结节染色阳性。成脂分化诱导2周后细胞中出现油红O染色阳性的脂滴。结论：使用全骨髓贴壁培养法可以获得高纯度，具有多向分化能力的MSCs。第二部分：大鼠阴道上皮细胞原代培养方法的改进目的：探讨大鼠阴道上皮细胞(VECs)体外培养的影响因素，对现有的VECs体外分离培养方法进行改进，建立大鼠阴道上皮细胞稳定的体外分离培养方法以用于组织工程。方法：酶消化法分离消化大鼠阴道上皮细胞。取阴道全层组织，修剪成1×0.5cm大小，移入超净台。组织块经4℃PBS清洗液彻底清洗6遍，加入中性蛋白酶Ⅱ型（DispaseⅡ），放4℃冰箱过夜消化18h。取出后经PBS冲洗，分离上皮层。上皮层加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA后37℃消化。轻轻吹打，DMEM/F12完全培养基终止消化，吸管吹打成单细胞悬液，200g，5min离心，KBM完全培养液重悬，细胞计数板计活细胞数量，细胞悬液以1.0×105个/cm~2的密度接种于培养板中，置细胞培养箱中静置培养。第2天首次换液，以后每两天换液一次。在此方法基础上比较大鼠不同动情周期（动情前期，动情期，动情后期），不同DispaseⅡ配置（PBS配置与KBM配制），不同DispaseⅡ浓度（0.6U/ml与1.2U/ml），不同胰蛋白酶消化方法（30min消化一次与10min重复3次），培养表面不同处理（FN/C包被及去离子水包被），不同培养基（KBM培养基与含6%FBS的KBM培养基）对大鼠阴道上皮细胞体外培养的影响，对上皮分离的结果进行评分，并观察48h首次换液时细胞贴壁情况。免疫细胞化学染色及免疫荧光检测广谱角蛋白AE1/AE3表达。扫描电镜观察细胞表面超微结构。结果：动情前期的大鼠阴道上皮层消化后可获得更多大鼠阴道上皮细胞（P=0.0346）；上皮层用KBM配制的DispaseⅡ消化后48h贴壁细胞多于用PBS配制的DispaseⅡ；1.2U/mlDispaseⅡ的分离结果评分及可获活细胞数高于0.6U/mlDispaseⅡ（P=0.025; P=0.034）；三步胰酶消化方法相比一步胰酶消化方法可获得更多的贴壁细胞；FN/C包被液处理的培养表面相比去离子水可以获得更多的贴壁细胞；大鼠阴道上皮细胞在含血清培养基中生长快，但易受成纤维细胞污染。经改良方法培养的VECs免疫细胞化学染色及免疫荧光显示广谱角蛋白AE1/AE3阳性。扫描电镜显示VECs呈镶嵌排列，细胞之间界限清晰，表面可见褶曲和微绒毛，呈不规则疏网状。结论：使用改良的原代培养方法可获得更多的大鼠阴道上皮细胞，细胞显示上皮细胞特征。第三部分：大鼠阴道上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞向上皮细胞的分化目的：探索体外诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向上皮细胞分化的可行性。方法：将阴道上皮细胞(VECs)铺于事先包被FN/C的0.4μm Transwellinsert共培养小室内，与铺有MSCs的6孔板建立间接共培养体系，诱导MSCs向上皮细胞分化。分别于0天、7天及14天时，移去小室，倒置显微镜下观察MSCs的形态变化。细胞爬片使用免疫细胞化学染色对诱导后的MSCs进行上皮细胞标志物广谱角蛋白AE1/AE3的检测。VECs和MSCs分别用作阳性及阴性对照。Western Blot检测上皮细胞标志物广谱角蛋白AE1/AE3的表达水平。GAPDH用作内参照物。结果：MSCs与VECs共培养诱导分化7天时，MSCs的形态由0天时长梭形开始变为上皮样的多边形。共培养14天时，更多MSCs变为多边形。免疫细胞化学染色表明经诱导7天及14天的MSCs广谱角蛋白AE1/AE3表达阳性；Western blot检测诱导后的MSCs表达AE1/AE3，诱导7天组AE1/AE3的蛋白水平高于0天组（36.28±1.49vs.1.00±0.00，P0.01），诱导14天组AE1/AE3的蛋白水平高于0天组（48.80±3.17vs.1.00±0.00，P0.01）及7天组（48.80±3.17vs.36.28±1.49，P=0.0232）。结论：VECs可以通过间接共培养的方式诱导MSCs向上皮细胞分化，上皮细胞标志物广谱角蛋白AE1/AE3的表达量随时间延长而增高。第四部分：骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）向上皮细胞分化过程中Wnt/β-catenin信号通路的可能作用。方法： MSCs和VECs间接共培养诱导分化。分别于0天、7天及14天时，，使用Western Blot对诱导后的MSCs及VECs进行Wnt/β-catenin信号通路的重要成分β-catenin，GSK-3β，pi-GSK-3β，TCF-3表达水平的测定。为研究Wnt信号通路在MSCs向上皮细胞分化中的调控作用，分三组进行MSCs和VECs的间接共培养诱导：(1)对照组加入含3%FBS的KBM培养液；(2) Wnt通路激动剂组加入含20μM氯化锂（LiCl）的3%FBS-KBM培养液；(3) Wnt通路抑制剂组加入含20ng/ml Dickkopf-1（DKK-1）的3%FBS-KBM培养液。于共培养第7天移去培养小室，使用Western Blot对诱导后的MSCs进行Wnt/β-catenin信号通路的重要成分β-catenin，GSK-3β，TCF-3及广谱角蛋白AE1/AE3的表达水平测定。GAPDH用作内参照物。结果：MSCs与VECs共培养7天时，Western blot检测诱导后的MSCs其β-catenin (1.50±0.11vs.1.00±0.00, P=0.009), pi-GSK-3β (1.50±0.23vs.1.00±0.00, P=0.09)及TCF-3(1.25±0.16vs.1.00±0.00, P=0.19)的表达量逐渐增加，GSK-3β的表达量(0.69±0.04vs.1.00±0.00, P=0.002)逐渐减少。共培养14天与共培养7天相比，β-catenin (1.85±0.23vs.1.50±0.11,P=0.24)与pi-GSK-3β (2.31±0.33vs1.50±0.23, P=0.114)的表达水平增高，GSK-3β (0.34±0.03vs.0.69±0.04, P=0.0021)及TCF-3(0.98±0.17vs.1.25±0.16, P=0.3144)的表达水平下降。GSK-3β的表达与β-catenin呈现出相反的趋势。pi-GSK-3β的表达与GSK-3β也呈现出相反的趋势。诱导7天时，20μM LiCl组β-catenin (1.24±0.07vs.1.00±0.00, P=0.02)，TCF-3(2.15±0.24vs.1.00±0.00, P=0.14)表达增加， GSK-3β(0.60±0.07vs.1.00±0.00, P0.01)表达减少；20ng/ml DKK-1组β-catenin(0.92±0.08vs.1.00±0.00, P=0.38)，TCF-3(0.77±0.09vs.1.00±0.00, P=0.06)表达减少，GSK-3β (1.11±0.03vs.1.00±0.00, P=0.02)表达增加。检测AE1/AE3的表达水平发现相比对照组，LiCl可以增加AE1/AE3的表达水平(1.20±0.18vs.1.00±0.00, P=0.32)，而DKK-1则降低AE1/AE3的表达(0.83±0.11vs.1.00±0.00, P=0.19)。结论：Wnt/β-catenin信号通路可能参与调控VECs诱导MSCs向上皮细胞分化的过程，使用LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路可以加速分化。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329

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