组胺受体2的激活通过扰乱心肌线粒体和内皮功能而加重心肌缺血再灌注损伤

发布时间：2020-05-29 15:30

【摘要】：背景与研究目的：组胺是人体组织内的一种广泛参与免疫反应和诱发炎症反应的有机氮化合物,它主要由嗜碱粒细胞和肥大细胞产生。研究表明,在应激条件下,心肌肥大细胞的激活和组织胺的释放广泛参与了一系列的心血管疾病的发生与发展,例如：心肌缺血再灌注损伤、心律失常、动脉粥样硬化、糖尿病、慢性心衰,等等。组胺受体1和受体2在心肌和血管内皮中均有表达,它们同属于G蛋白偶联受体家族,在一系列的细胞信号转导的过程中起到重要的调节作用。动物实验和临床试验均表明,组胺受体2的阻断能改善心肌缺血再灌注损伤和缓解心衰并提高患者的生存率。但是,这种保护作用的机制目前并不十分清楚。组织胺受体2的激活在冠心病当中的机制普遍认为是与β1肾上腺素受体介导的cAMP-PKA信号机制相同,除此之外并无深入的探讨和研究。目前的研究已经证实组胺受体2的拮抗剂对于神经元的凋亡具有保护作用。同时,还有大量的研究表明心肌线粒体功能和血管内皮功能的紊乱在心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程中起到至关重要的作用。但是,组织胺受体2的激活对心肌线粒体功能和内皮功能影响的研究并无报道。因此,本研究假设组胺受体2的激活能通过增加心肌线粒体通透性和血管内皮通透性而加重心肌的缺血再灌注损伤。本研究的目的在于探讨组织胺受体2的过度激活对小鼠心肌缺血再灌注损伤的影响以及探讨其具体的作用机制。研究方法： 1.病人血清的组胺浓度测定收集急性心梗病人(AMI≤6d)、不稳定性心绞痛病人和健康人全血,用ELISA方法测定血清组胺浓度。 2.细胞分离培养和细胞毒性实验分离培养原代SD乳鼠心肌细胞和传代培养脐静脉内皮细胞。应用MTT和Hoechst方法检测不同浓度组胺(0.01-100u M)对心肌细胞存活率和凋亡率的影响。 3.心肌缺血和缺血再灌注损伤模型的建立和处理 11-12周龄C57BL/6雄性小鼠和组胺受体2基因敲除小鼠,体重约25-30g,戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉。经胸骨左侧第四肋间开胸,暴露心脏。以8-0尼龙线穿过左心耳下缘1-2mm处的2/3心肌层,短暂结扎或永久结扎左侧冠状动脉,诱导心肌缺血45min后解除结扎使其再灌注24h或永久梗死24h。实验各分为6组,每组5只,组别为：WT-sham, WT-control, WT-AD, KO-control, WT-fam, WT-fam+AD,组胺受体2特异性阻断剂fam (famotidine)和特异性激动剂AD (amthamine dihydrobromide)分别于术前30min腹腔注射给药,术后24h处死存活的小鼠,提取心脏,分别进行western blot、免疫组化和TTC染色。用于蛋白分析的小鼠心脏保存于-80℃；用于免疫组化的小鼠心脏横切后置于4%多聚甲醛中固定24h再进行脱水和石蜡包埋；用于TTC染色的小鼠心脏先冻于-20度15min,取出后均匀切成5片用TTC染色进行心梗面积分析。 4.基因和蛋白表达分析提取原代培养的SD乳鼠心肌细胞和传代培养的脐静脉内皮细胞的总RNA后再逆转录成cDNA,对鼠或人的ANP (atrial natriuretic peptide)、β-MHC (beta-myosin heavy chain)、TNF-α (tunour necrosis factor alpha)、4个组胺受体、(3-actin和GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)进行PCR扩增。提取原代培养的心肌细胞、脐静脉内皮细胞和小鼠心肌组织总蛋白或分离原代培养的心肌细胞和小鼠心肌组织线粒体蛋白,应用抗体检测bax, COX-IV, ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2), p-ERK1/2, DAPK-2(death-associated protein kinase2), p-DAPK-2, caspase3, moesin, p-moesin和β-actin的蛋白表达水平并应用Image J进行半定量分析。将小鼠心脏组织石蜡包埋后切片为5μM厚度,应用抗体检测心肌组织中MPO (myeloperoxidase)和caspase3的表达水平。 5.心肌细胞线粒体通透性和线粒体去极化检测乳鼠心肌细胞分离培养48h后加入1uM浓度的组胺或AD刺激24小时,PBS冲洗3遍后加入1.0mM的钙黄绿素和1.0mM的氯化钴置于37度染色20min,然后应用荧光显微镜观察线粒体中绿色荧光的强弱来反映线粒体膜通透性。为了检测线粒体去极化,加入组胺受体2特异性激动剂AD刺激24小时后,首先应用钙黄绿素对细胞进行染色,然后应用25nM的MitoTracker对线粒体染色10min,最后荧光显微镜下观察线粒体膜电位的变化。此外,单独加入25nM的MitoTracker对心肌细胞染色后收集细胞,PBS冲洗5次后在流式细胞计数仪下记录心肌细胞当中线粒体膜电位的变化情况。 6.心肌细胞和脐静脉内皮细胞p-ERK1/2定位分析加入1μM浓度的组胺刺激乳鼠心肌细胞和脐静脉内皮细胞24h后,抗体孵育过夜结合细胞中的p-ERK1/2,同时应用DAPI标记心肌细胞的细胞核或应用罗丹明鬼笔环肽标记内皮细胞的F-actin,再应用荧光显微镜对p-ERK进行细胞定位检测。 7.脐静脉内皮细胞通透性测量将脐静脉内皮细胞传代接种于Transwell细胞培养皿的上层小室中培养48小时后,加入1μM浓度的组胺刺激,在3h内各个时间点应用电阻测量仪对单层脐静脉内皮细胞的电阻进行测量和记录。结果： 1.急性心梗病人血清组胺浓度增加 ELISA检测结果显示急性心梗病人血清组胺浓度高达32.9ng/ml,较不稳定性心绞痛和正常人水平明显升高2倍左右(P0.05),而不稳定性心绞痛患者与正常人之间无统计学差异。同时,多元回归分析结果显示血清组胺浓度与急性心梗具有相关性(P0.001),而与年龄、性别和药物治疗无相关性。这表明血清中组胺的浓度与急性心梗密切相关。 2.组胺引起心肌细胞的损伤和凋亡 1μM组胺刺激24h后,心肌细胞内ANP, β-MHC的mRNA水平明显增加。组胺刺激24h后,ANP的蛋白水平亦明显增高,组胺受体2阻断剂法莫替丁预处理能阻断这一现象。MTT和Hoechest分析结果显示组织胺在0.01μM时对心肌细胞生存和凋亡无明显影响,但是在0.1-100μM的浓度时能显著减少心肌细胞的生存率和增加心肌细胞的凋亡(P0.05),提示高浓度的组胺刺激可以诱导心肌细胞凋亡。 3.组胺受体2的激活增加TNF-α的生成和ERK1/2的磷酸化 1gM的AD刺激心肌细胞和脐静脉内皮细胞24h后,TNF-α的mRNA表达水平明显增加,组胺受体2阻断剂法莫替丁能抑制这一现象(P0.05)。此外,在10ng/mL的TNF-α刺激心肌细胞和脐静脉内皮细胞24h后发现ERK1/2的磷酸化水平明显增加(P0.05)。 4.组胺受体2的激活引起心肌细胞凋亡的信号通路与bax、p-ERKl/2、 P-DAPK2和caspase3有关 1μM组胺刺激心肌细胞24h后,心肌细胞胞浆的bax水平明显增加,法莫替丁预处理能阻断这一效应。1gM组胺和AD都能增加bax的线粒体转位,法莫替丁能抑制bax的线粒体转位现象。由于ERK1/2能调控细胞增值和细胞凋亡,ERK1/2入核启动了细胞的增值,而胞浆中ERK1/2的聚集可使促凋亡蛋白DAPK2磷酸化水平增高,从而启动线粒体途径之外的细胞凋亡。因此我们对ERK1/2和DAPK2的磷酸化状态进行了研究。结果显示组胺受体2的激活上调胞浆中ERK1/2和DAPK2的磷酸化水平,并增加caspase3的表达,这种信号变化被法莫替丁或ERK1/2抑制剂U0126阻断。 5. ERK1/2在胞浆的聚集增加心肌细胞线粒体膜的通透性和去极化 1gM组胺刺激心肌细胞24h后,荧光显微镜观察结果显示心肌细胞胞浆当中的p-ERK1/2明显增加,同时并未发现p-ERK1/2的核转移现象。钙黄绿素和氯化钴共孵育的结果显示,组胺和AD刺激24h后的心肌细胞线粒体内钙黄绿素的绿色荧光较对照组明显降低,这表明组胺通过组胺受体2增加线粒体膜的通透性,进而使线粒体中的钙黄绿素溢出到胞浆被氯化钴淬灭。在培养基中加入组胺受体2阻断剂法莫替丁或ERK抑制剂U0126抑制线粒体通透转换孔的开放。钙黄绿素和MitoTracker双染的结果以及MitoTracker的流式结果同样也显示组胺和AD刺激24h后心肌细胞线粒体膜电位发生去极化,组胺受体2阻断和ERK抑制能减轻线粒体膜电位的降低。这些结果表明组胺通过激活组胺受体2增加线粒体膜的通透性和去极化。 6.组胺通过激活组胺受体2增加单层脐静脉内皮细胞的通透性与对照组相比,跨膜电阻测量的数据显示1μM组胺刺激脐静脉内皮细胞3h内,其通透性明显增加,组胺受体2阻断剂法莫替丁能逆转这一效应(P0.05)。免疫印迹显示1gM的组胺或AD增加脐静脉内皮细胞ERK1/2和moesin的磷酸化水平,这一改变能被组胺受体2阻断剂法莫替丁和ERK抑制剂U0126阻断(P0.05),提示ERK1/2和moesin可能参与了通透性的改变。 7.组胺受体2激活介导小鼠心肌内中性粒细胞浸润和心肌细胞凋亡免疫组化检查发现,与假手术组(WT-sham)相比,在心肌缺血45分钟再灌注24小时后,对照组(WT-control)小鼠心肌中MPO和caspase3的表达水平明显上调(P0.05),组胺受体2特异性激动剂AD注射组(WT-AD)心肌中MPO和caspase3的表达水平进一步增高,而组胺受体2阻断剂法莫替丁腹腔注射组(WT-fam)和组胺受体2基因敲除组(KO-control)心肌组织中的MPO和caspase3的表达水平均较对照组降低(P0.05)。这些结果表明组胺受体2的激活介导了缺血再灌注时心肌的中性粒细胞浸润和心肌细胞的凋亡。 8.组胺受体2阻断或敲除减少心梗面积心肌缺血45min再灌注24h导致野生型小鼠心肌产生15%左右的坏死,而腹腔注射组胺受体2阻断剂法莫替丁或组胺受体2基因敲除均显著减少心肌梗死面积(P0.05)。相反,腹腔注射组胺受体2激动剂AD则增加心肌梗死面积至20%左右。同时,在小鼠心肌缺血24小时的动物模型中也观察到类似的趋势。此外,心肌缺血45min再灌注24h后心脏组织蛋白免疫印迹结果显示缺血再灌注能增加ERK1/2和DAPK2的磷酸化水平和增加bax的线粒体表达,而组胺受体2基因敲除能减少它们的表达水平(P0.05)。结论： 1.急性心梗病人血清中组织胺浓度可高达32.9ng/mL,较正常人和不稳定性心绞痛病人显著增高,提示组胺浓度可作为诊断急性心梗的一个重要的指标。 2.组胺通过激活组胺受体2促进心肌细胞胞浆中bax的线粒体转位和p-ERK1/2的聚集,分别增加caspase3的释放和DAPK2的磷酸化水平,从而介导线粒体依赖途径和非线粒体依赖途径的心肌细胞的凋亡。 3.组胺通过组胺受体2诱导内皮细胞通透性改变,从而加剧缺血再灌注过程中中性粒细胞的浸润,其机制与TNF-α、ERK1/2和moesin的激活有关。 4.心肌缺血再灌注的过程中,组胺受体2的激活通过增加心肌细胞线粒体功能和内皮功能的紊乱而加重了缺血再灌注损伤,组胺受体2阻断剂法莫替丁能减轻心肌的梗死面积,提示组胺受体2阻断可以作为心肌缺血再灌注损伤的一项新的治疗措施。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【共引文献】