汉滩病毒多组分新型重组腺病毒的制备及免疫学特性研究

发布时间：2020-05-30 14:01

【摘要】：【背景】汉坦病毒感染可引起两类不同的严重感染性疾病，即肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantaviruspulmonary syndrome，HPS）。其中HFRS多见于亚洲及东北欧部分地区，主要由汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）、首尔病毒（Seoul virus，SEOV）和普马拉病毒（Puumalavirus，PUUV）等引起。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，流行范围广，发病人数多，病死率较高。HFRS是我国危害最严重的急性传染病之一。目前我国已研制成功HFRS灭活疫苗，其推广使用对预防HFRS的发生和流行起到了积极作用。但该类疫苗仍存在一些问题，主要是不能有效刺激细胞免疫应答，诱导机体产生中和抗体的能力也较弱，抗体滴度不高；此外，目前对于灭活疫苗在制备与使用中的安全性尚存在一些争议。因此，研发新型的HFRS疫苗将有助于进一步提高我国对HFRS的防控水平。汉坦病毒基因组包括L、M、S等3个片段，分别编码病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Gn、Gc以及核衣壳蛋白（nucleoprotein，NP）。GP和NP都是诱导机体免疫应答的主要结构蛋白，其中的Gn及Gc可刺激机体产生中和抗体，在机体的保护性体液免疫应答中起主要作用，但其免疫原性较弱，特别是刺激机体细胞免疫应答的能力较弱；NP的免疫原性很强，特别是在NP上存在多个CTL表位，在诱导机体细胞免疫应答中起主要作用，可有效保护汉坦病毒对实验动物的攻击。因此，同时应用汉坦病毒GP与NP作为重组疫苗的组分有可能达到优势互补，提高免疫应答效果的目的。本实验室前期构建了含HTNV S基因0.7kb片段与M基因嵌合基因的一系列原核与真核表达载体，并进行了融合表达以及基因免疫。结果表明，嵌合基因表达的融合蛋白能有效刺激机体的体液免疫应答以及部分细胞免疫应答；在不同的表达系统中，以重组腺病毒免疫的效果为好，但仍存在融合蛋白的表达量偏低以及诱导机体免疫应答水平尚不理想的问题。针对这些问题，本实验室正试图通过对表达载体进行改建，改善目的基因的构成，采用不同的表达方式，联合使用不同的分子佐剂等多种策略，来提高目的抗原的表达量及其诱导机体免疫应答的能力，本研究的目的亦在于此。【方法】本研究在采用CAG启动子及HSP70C分子佐剂的基础上，采取两条不同的技术路线，构建多株含HTNV不同结构蛋白及其CTL表位、不同组合方式、不同表达方式的重组腺病毒，并对构建的重组腺病毒诱导小鼠体液免疫应答和细胞免疫应答的情况进行观察和比较。（1）考虑到HTNV GP的表位为空间构像依赖，将GP与NP融合表达可能会影响其空间构型，从而影响到免疫原性，本研究使用脑心肌炎病毒内核糖体进入位点（ECMV IRES）将GP、NP在同一腺病毒中分别表达，更有利于保持其免疫学活性。（2）加入有效的HTNV CTL表位基因（NP127～141aa、NP331～345aa及NP421～429aa，以加间隔序列AAY的方式串联），以提高融合蛋白刺激机体免疫应答的能力，特别是提高细胞免疫应答的能力。【结果】第一部分含HTNV结构基因双顺反子及HSP70C的重组腺病毒的制备及免疫学特性研究 1．构建了可分别表达HTNV GP、NP及HSP70C的重组腺病毒载体，转染HEK293A细胞后，获得了8株重组腺病毒，分别命名为rAd-GnH-IRES-S0.7H、rAd-GcH-IRES-S0.7H、 rAd-GnH-IRES-S0.7、 rAd-GcH-IRES-S0.7、 rAd-Gn-IRES-S0.7H、rAd-Gc-IRES-S0.7H、rAd-Gn-IRES-S0.7、rAd-Gc-IRES-S0.7。重组腺病毒经纯化并测定滴度后，以100pfu/cell的病毒量感染HEK293A细胞，免疫荧光检测结果显示，所有重组腺病毒均可表达目的蛋白。 2．将上述各重组腺病毒通过腹腔途径免疫C57BL/6小鼠，以腺病毒空载体、PBS及HFRS灭活疫苗为对照。通过ELISA及微量细胞培养中和试验对各组小鼠体液免疫应答的情况进行了检测。结果显示，各重组腺病毒均可刺激小鼠产生针对HTNVGP、NP的特异性抗体及中和抗体，且添加HSP70C的各重组腺病毒免疫组抗体的几何平均滴度（GMT）均高于对应的未添加组；在含Gn的各重组腺病毒组中，rAd-GnH-IRES-S0.7H免疫组小鼠血清的抗GP、NP抗体及中和抗体的GMT均为最高，分别为95.1、320.0和30.3；在含Gc的各重组腺病毒组中，rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫组小鼠血清的抗GP、NP抗体及中和抗体的GMT均为最高，分别为80.0、380.5和40.0；该两种重组腺病毒诱导的中和抗体均高于灭活疫苗组（p0.05）。 3．对上述各重组腺病毒免疫小鼠的细胞免疫应答情况进行了检测。CTL杀伤实验的结果表明，融合HSP70C的两种重组腺病毒（rAd-GnH-IRES-S0.7H和rAd-GcH-IRES-S0.7H）免疫组小鼠的脾细胞在各效靶比下杀伤效应均为最好，且均高于灭活疫苗组（p0.05）。ELISPOT检测的结果表明，在各肽池刺激下rAd-GnH-IRES-S0.7H及rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫组小鼠脾细胞的IFN-分泌水平均为最高，且均高于灭活疫苗组（p0.05）。表明融合HSP70C的重组腺病毒能更好的诱导机体的细胞免疫应答。在使用重叠肽段作为刺激物进行的ELISPOT实验中，NP3肽池显示出了最好的刺激效果，表明HTNV的NP在诱导机体细胞免疫应答中的作用比GP更为重要。 4．用HTNV76-118株攻击各重组腺病毒免疫的小鼠，，采用ELISA及RT-PCR对感染小鼠的部分脏器进行检测，结果显示，各重组腺病毒免疫组小鼠脏器中的病毒抗原及病毒核酸量均低于PBS对照组及空载免疫组，其中rAd-GnH-IRES-S0.7H免疫组及rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫组小鼠的HTNV抗原及核酸含量均为最低，且与灭活疫苗组无显著差别（p0.05），表明其保护效果与灭活疫苗组相当。第二部分含HTNV嵌合基因、CTL串联表位及HSP70C的重组腺病毒的制备及免疫学特性研究 1．构建了含HTNV S基因0.7kb片段与M基因的嵌合基因、CTL串联表位及HSP70C的重组腺病毒载体，转染HEK293A细胞后，获得了4株重组腺病毒，分别命名为rAd-GnS0.7-CTLH、rAd-GnS0.7-CTL、rAd-GcS0.7-CTLH、rAd-GcS0.7-CTL。重组腺病毒经纯化并测定滴度后，以100pfu/cell的病毒量感染HEK293A细胞，免疫荧光检测结果显示，所有重组腺病毒均可表达目的蛋白。 2．将上述各重组腺病毒通过腹腔途径免疫C57BL/6小鼠，以腺病毒空载体、PBS及HFRS灭活疫苗为对照。通过ELISA、微量细胞培养中和试验对各组小鼠体液免疫应答的情况进行了检测。结果显示，各重组腺病毒均可刺激小鼠产生针对HTNVGP、NP的特异性抗体及中和抗体，且添加HSP70C的两个重组腺病毒免疫组抗体的GMT均高于对应的未添加组；其中rAd-GnS0.7-CTLH免疫组小鼠血清的抗GP、NP抗体及中和抗体的GMT分别为80.0、320.0和26.4，均高于rAd-GnS0.7-CTL免疫组；rAd-GcS0.7-CTLH免疫组小鼠血清的抗GP、NP抗体及中和抗体的GMT分别为113.1、452.5和30.3，该两种重组腺病毒诱导的中和抗体均高于灭活疫苗组（p0.05）。 3．对上述各重组腺病毒免疫小鼠的细胞免疫应答情况进行了检测。CTL杀伤实验的结果表明，rAd-GnS0.7-CTLH免疫组在各效靶比下，杀伤效应均强于rAd-GnS0.7-CTL组，且在效靶比为100:1时也强于灭活疫苗组（p0.05）；rAd-GcS0.7-CTLH免疫组在各效靶比下，杀伤效应均强于rAd-GcS0.7-CTL组，且在效靶比为10:1及100:1时也强于灭活疫苗组（p0.05）。ELISPOT检测的结果表明，在各肽池刺激下rAd-GnS0.7-CTLH及rAd-GcS0.7-CTLH免疫组小鼠脾细胞的IFN-分泌水平均为最高（p0.05）；rAd-GcS0.7-CTLH免疫组IFN-分泌水平高于灭活疫苗组（p0.05），在除Gn2肽池外的各肽池刺激下rAd-GnS0.7-CTLH组IFN-γ的分泌水平也高于灭活疫苗组（p0.05）。同样表明融合HSP70C的重组腺病毒能更好的诱导机体的细胞免疫应答。以本研究所采用的CTL表位序列的三个单独的15aa的肽段分别作为刺激物进行ELISOPT实验，结果显示NP48及NP60肽段的刺激效果最好，表明其包含的CTL表位在诱导细胞免疫应答中的作用更为突出。 4．用HTNV76-118株攻击各重组腺病毒免疫后的小鼠，采用ELISA及RT-PCR对感染小鼠的部分脏器进行检测，结果显示，各重组腺病毒免疫组小鼠脏器中的病毒抗原及病毒核酸量均低于PBS对照及空载免疫组，其中rAd-GnS0.7-CTLH免疫组及rAd-GcS0.7-CTLH免疫组小鼠的HTNV抗原及核酸含量均为最低，且与灭活疫苗组无显著差别（p0.05），表明其保护效果与灭活疫苗组相当。【结论】本研究在采用CAG启动子及HSP70C分子佐剂的基础上，采取两条不同的技术路线进一步优化了HTNV结构蛋白在重组腺病毒中的表达，并藉此提高其诱导机体免疫应答的效果。一系列体内外实验的结果表明，采用将HTNV GP和NP分别与HSP70C融合，并用IRES将两种融合蛋白分别表达的策略构建的重组腺病毒，其诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的能力均得到了提升；采用同时添加CTL串联表位及HSP70C的策略构建重组腺病毒，也可有效提升其诱导体液免疫应答及细胞免疫应答的能力。上述两种策略构建的重组腺病毒诱导的免疫应答在多数指标上均优于灭活疫苗或与之相同；相比较而言，前一种策略构建的重组腺病毒在诱导体液免疫应答方面更具优势，而后一种策略在诱导细胞免疫应答方面更具优势。未来我们将综合运用上述两种策略，以期获得更好的免疫保护效果，为HFRS新型疫苗的研制提供理论、实验和物质基础。
【图文】：

适应性免疫,复合物

图2 HSP-肽段复合物与固有免疫及适应性免疫(80)SP-peptides complex associated with innate and adaptive im一类界定最为确切的HSP，广泛分布于各种细胞中。纯效刺激固有免疫应答，刺激单核细胞、巨噬细胞及树突状因子(87)。此外，表达在细胞表面的HSP70还可作为NK细性免疫方面，HSP70可与来源于肿瘤、病毒或人工构建的多MHC分子，活化抗原特异的CD4+及CD8+T细胞(89)。此外共刺激分子的表达(90)。Lehner等(91)对HSP70晶体结构的分彼此分离的结构域，即N端的44 kDa ATPase结构（1～35合结构域（359～494 aa）及10 kDa结构域（495～609 aa）要来源于其C端，N端的ATPase区域缺乏则此类功能，HSP子、IL-12、TNF-α、NO等，还可促进树突状细胞的成熟

转移载体,酶切鉴定

12 kb6.0 kb5.0 kb3.0 kb2.0 kb1.5 kb1.0 kb0.5 kb12 kb6.0 kb5.0 kb3.0 kb2.0 kb1.5 kb1.0 kb0.5 kb重组转移载体 pCAG-HSP70C-IRES-S0.7HSP7及 pCAG-HSP70C-IRES-S0.7 酶切鉴定结果g.5 Restriction enzyme analysis of transfer vectoP70C-IRES-S0.7HSP70C and pCAG-HSP70C-Ide range maker; M2: DL2000 marker; M3: DNA wide ranCAG-HSP70C-IRES-S0.7HSP70C clones (NotⅠ+AflⅡ)2: pCAG-HSP70C-IRES-S0.7 clones (NotⅠ+BstXⅠ).
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【共引文献】