核定位信号筛选系统的构建和基因文库的筛选以及核定位蛋白功能的研究

发布时间：2020-06-01 22:27

【摘要】： 转录因子及其它许多在细胞增殖、分化等方面发挥重要作用的蛋白如组蛋白、DNA和RNA聚合酶、RNA加工蛋白等均在细胞核内发挥作用、大多数核内蛋白需要内源性的核定位信号（nuclear localization signal，NLS）帮助其穿越核孔复合物而进入细胞核。这个过程包括转运蛋白（又称NLS-结合蛋白）识别和结合带有NLS的蛋白，并携带其停靠于核膜上，然后以耗能的主动运转方式使之进入细胞核。尽管核蛋白的胞浆——胞核转运机制目前尚未完全清楚，但是这个转运系统在进化过程中非常保守。从酵母到哺乳类，核孔复合物的结构非常相似，转运蛋白也具有很高的同源性。因此，哺乳类蛋白的 NLS在酵母细胞中同样可以发挥作用。据此，我们利用酵母构建了从cDNA 文库中捕获核定位蛋白基因片段的遗传筛选系统——核定位信号筛选系统。该系统包括两个部分：一是酵母穿梭载体，可表达不含NLS的人工转录因子，并含有一个出核信号（nuclear export signal、NES）以保证在没有NLS存在时人工转录因子定位于胞浆而不能进入细胞核激活转录。二是酵母宿主，其基因组中含有由人工转录因子调控的报告基因。将cDNA文库插入人工转录因子下游的多克隆位点后转化酵母宿主。如果与人工转录因子融合表达的cDNA 第四军区大学俗士学位论文编码一 NLS，人工转录因子就可进入细胞核而激活报告基因的转录，表现为酵母可在选择性培养基上生长，反之则不能。因此利用这个方法理论上可以从 CDNA文库中筛选到所有的核定位蛋白基困。本研究的主要内容包括： 1，设计并构建了核定位信号筛选系统，利用已知的编码＊u和不编码＊u 的基因片段进行了验证，证实了该系统能够有效地甄别表达的融合蛋白中 NLS的有无。验证了NLS在蛋白质中的位置不会影响筛选的效果． 2，将小鼠胚胎的cDNA文库插入筛选栽体的多克隆位点，转化酵母宿主，，其中约 l～2O的克隆可在选择性平板上生长。DNA序列分析表明 600’J上的克隆的插入片段可编码典型或不典型的NLS并与载体中的人工转录因子正确融合。用EGFP融合的方法验证它们在哺乳动物细胞中的定位，证实了这一系统能够有效地从 CDNA文库中筛选出核定位蛋白基因片段。因此这一系统可作为大规模筛选核定位蛋白基困的一种有效途径。从文库筛选出来的基因中，选取了两个基因，分别代表已知和未知、有典型NLS和无典型NLS．对它们进行了初步的功能研究． 3，Txrebl07肛pL6 的研究：利用核定位信号筛选系统确定核糖体蛋白 L6（山osomal Protein L6，RPL6）的 NLS的位置，并在体外培养的细胞中加以证实。氨基端的3041和68－84 AL酸残基具有核定位及核仁定位功能。随看表达量的提高，RpLO逐渐从核仁定位而成为全细胞核定位。Normem 杂交和RTPCR的结果显示，在胚胎期和未分化的细胞中Taxreb107呵L6 的表达量明显高于成熟组织和已分化的细胞。RpL6又称Taxr eb 07厂 resPonslvedeme血bindee erotei…，是HTLVI原癌蛋白Tx应答序夕J结合蛋白．通过筛选噬菌体文库克隆了 Taxrb 07伽L6的基困组基困，并对外显子呐含子的结构进行了分析．Taxrebl07／RpL6的启动子含有多种包括 NF－KB在内的特殊转录因子的识别位点。我们发现，Taxrb 07帅L6的启动子具有持续激活的特点。Tx对 Taxreb 07／RpL6的表达和启动子的活性一下四军医大掌协士学位论文具有上调的作用，这种作用是通过启动子上的NFch识别位点实现的。由于 HTLVIS’LTR中的 Txrebl07帅L6识别序歹］对 Tx的反式激活有促进作用，而我们又发现Taxr N07wL6能够与Tx直接进行相互作用，所O， Tx通过NF－oh上调 Taxrb107瓜pL6的表达，＆ Taxrbl07服pL6可能作用于5’LTR及细胞蛋白质的合成，n ＆促进T HTLV病毒感染细胞的增生和病毒基因组的复制。此外，Taxlebl 07彻L6的表达还受到INF和EPO 的调控。总之，Taxrebl07伽L6可能通过多种途径参与了细胞的增生、分化及转化等多种生理和病理活动。 4，新的核蛋白 J207的研究：我们筛选到一个功能未知的，J、鼠的 CDNA，全长共1802七，开放读框有1464七，编码488个氨基酸。PSORT软件分析表明，J207没有典型的核定位信号，但它具有七次跨膜样的结构域和分泌性信号肽样的结构域。利用核定位信号筛选系统及体外培养的细胞都证实全长的J207确实定位于细胞核中。按照软件分析的结果将全长片段分为。细胞外段” 和“细胞内及段跨膜区”，分别转染细胞，发现“细胞外段”定位在细胞核中而“细胞内及段跨膜区”定位在内质网中。用BLAST软件在仇阳盯出中没有发现与之同源的核菩酸序列，但人类基因组（Geallnd 的登录号为 ill25408）中包含这段序PI］。分析表明N的 J207可能具有两个启动子和两种不同的拼接方式，并且广泛表达于各种组织
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2001
【分类号】：Q785

【共引文献】