钩端螺旋体诱导巨噬细胞凋亡机制及其抗原表位免疫保护作用研究

发布时间：2020-06-02 11:16

【摘要】：背景及意义：钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的全球性流行人兽共患传染病。尽管致病性钩体血清群、型众多,但我国流行最广的致病性钩体为问号钩体(Leptospira interrogans)黄疸出血群赖型。巨噬细胞和中性粒细胞均能吞噬钩体,但仅有巨噬细胞能杀灭吞噬的钩体。我们以往研究发现,问号钩体感染的人和小鼠巨噬细胞线粒体有明显病变,但线粒体相关经典的caspase9/3-细胞色素c凋亡信号通路未激活,故线粒体是否参与问号钩体感染性巨噬细胞凋亡有待于研究证实。我们推测问号钩体极有可能通过线粒体相关caspase非依赖凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)和核酸内切酶G(endonuclease G,EndoG)通路诱导巨噬细胞凋亡,研究结果有助于进一步揭示问号钩体分子及细胞致病机制。 方法：建立问号钩体黄疸出血群赖型赖株感染小鼠J774A.1巨噬细胞和人THP-1巨噬细胞模型。采用激光共聚焦显微镜技术检测感染前后细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)变化及DNA损伤情况。采用流式细胞术测定感染前后细胞周期及细胞凋亡情况。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)了解感染前后细胞周期调控以及凋亡相关基因mRNA水平变化。采用Western blot检测感染前后细胞周期、凋亡相关蛋白表达及相关激酶磷酸化水平。采用siRNA沉默p53基因、抑制剂阻断靶蛋白的方法,反向验证上述基因或靶蛋白在问号钩体感染性巨噬细胞周期阻滞及凋亡中的作用。 结果：问号钩体感染导致巨噬细胞ROS水平迅速升高,高浓度ROS引起细胞DNA损伤,表现为53BP1蛋白核内聚集及H2AX蛋白磷酸化。DNA损伤使p53蛋白磷酸化激活并上调p21Cip1/WAF1基因表达,Akt激酶去磷酸化导致P27Kip1基因表达上调,p21Cip1/WAF1和p27Kip1蛋白共同引起细胞周期的迅速阻滞于G1期并出现凋亡现象。问号钩体感染过程中,人和小鼠巨噬细胞Bcl-2家族中促凋亡的Bax、Noxa、Puma蛋白表达上调,抗凋亡的Bcl-2蛋白表达下调,AIF和EndoG蛋白从线粒体释放至胞浆中,Fas蛋白表达上调并加速募集于细胞膜。p53基因被沉默或p53信号通路被阻断后,问号钩体感染引起的巨噬细胞G1期阻滞现象明显减少、细胞凋亡率也显著下降。 结论：问号钩体感染巨噬细胞后可导致胞内ROS迅速升高及DNA损伤,DNA损伤激活的p53通过线粒体相关caspase非依赖p53-Bax/Noxa/Puma-AIF/EndoG信号通路导致巨噬细胞的凋亡。 背景及意义：钩端螺旋体病由致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的全球性流行人兽共患传染病,我国也是钩体病流行的主要疫区之一。接种疫苗是预防和控制钩体病流行最为有效的措施。目前普遍使用的钩体疫苗主要是根据当地流行的数种优势钩体血清群、型制备的多价钩体全菌死疫苗。然而,致病性钩体血清群型众多,不同地区主要流行的钩体血清群型存在明显差异；钩体疫苗对其未包含的钩体血清群、型无明显的保护作用。此外,钩体疫苗副作用较大,使该疫苗应用受到很大限制。因此,研制对不同钩体血清群型有交叉保护作用的高效无毒通用性钩体新疫苗,对于钩体病预防和控制具有重要意义。 方法：采用PCR扩增我国流行的主要致病性问号钩体血清群型属特异性外膜蛋白ligB、loa22、lipL32、groEL和lenA基因,T-A克隆后测序并比较其序列保守性。以问号钩体黄疸出血群赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增上述基因并构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE联合凝胶图象分析系统,检查目的重组蛋白rLigB、rLoa22、rLipL32、rGroEL和rLenA表达情况及表达量。采用Ni-NTA亲和层析法提纯上述重组蛋白,免疫家兔制备相应抗血清及其抗体。采用生物信息学软件预测LigB、Loa22、LipL32、GroEL和LenA中的T细胞和B细胞(T-B)联合抗原表位。采用噬菌体展示系统,制备含T-B联合抗原表位的重组噬菌体PⅢ蛋白。采用Western blot和ELISA分别鉴定重组PⅢ蛋白中T-B联合抗原表位和人工合成T-B联合抗原表位肽的免疫反应性。 结果：8群8型问号钩体均含ligB、loa22、lipL32和groEL基因,但仅有部分受检问号钩体血清群型含lenA基因。上述基因氨基酸序列相似性分别为：ligB基因89.42%～98.63%、Ioa22基因92.82%～100%、lipL32基因98.53%～100%、groEL基因96.52%～100%。所构建的各靶基因原核表达系统均能有效表达其重组蛋白。噬菌体展示及Western blot和ELISA结果显示,LigB中LigB-371、LigB-744、 LigB-1528以及LipL32中LipL32-13、Loa22中Loa22-90、GroEL中GroEL-215是优势T-B联合抗原表位。 结论：LigB、Loa22、LipL32和GroEL是问号钩体属特异性外膜蛋白,其中LigB-371、LigB-744、LigB-1528、Loa22-90、LipL32-131、GroEL-215是优势T-B联合抗原表位,可用于制备通用性问号钩体多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)疫苗。 背景及意义：钩端螺旋体病由致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的全球性流行人兽共患传染病,但致病性钩体感染过程中毒力基因表达调控机制不明。RpoN,又称Sigma54,是一种重要的原核细胞转录因子,但敲除RpoN基因导致钩体死亡。与其他原核细胞Sigma因子不同,RpoN必须被转录激活因子——增强子结合蛋白(enhancer binding protein, EBP)激活后才能发挥转录调控作用。迄今RpoN在多种细菌中被证实与氮代谢基因甚至毒力基因表达调控有关,但RpoN在致病性钩体中迄今未见研究报道。本研究中,我们构建了致病性问号钩体RpoN的EBP基因(fhlA)敲除突变株,通过突变株与野生株比较,间接了解RpoN对问号钩体生长繁殖的影响及其调控的靶基因。 方法：采用生物信息学软件并根据RpoN调控基因启动子序列特征,预测并分析了钩端螺旋体基因组中RpoN、EBP编码基因及其调控的靶基因。构建RpoN基因原核表达系统并提纯目的重组蛋白(rRpoN).采用凝胶迁移试验(gelelectrophoresis mobility shift assay, EMSA)筛选rRpoN调控的靶基因。采用随机转座突变法构建问号钩体fhlA基因敲除突变株(ΔfhlA)。采用实时荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)检测AfhlA突变株中候选靶基因nRNA水平变化。采用暗视野显微镜计数法测定突变株与野生株在不同pH或氮源条件下生长曲线及菌株形态变化。采用Western blot法检测突变株与野生株部分外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)表达情况。 结果：致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株有一个RpoN基因和fhlA和atoC两个EBP编码基因以及15个含RpoN启动子序列的靶基因,非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc1株也有一个RpoN基因,但仅有一个EBP基因(fhlA) EMSA结果显示,rRpoN可与lpxC(LA2306)、secE(LA3426)、glnA(LA1313)、 amtB(LA3806)以及LA1188、LA1968、LA2430、LA0773基因启动子序列结合。Δfh1A突变株LA1188、LA1968及amtB基因mRNA水平显著下调(P0.05),其他靶基因mRNA水平无明显变化。AfhlA突变株与野生株均可利用NH4Cl和谷氨酰胺作为氮源并正常繁殖,但在缺氮培养基中均不能进入对数生长期。AfhlA突变株有钩体典型、活泼的运动方式,但外形变短(野生株21.7μm,突变株12.2μm)。Western blot结果显示,受检的5种OMP中,仅有OmpR表达上调。 结论：致病性钩体RpoN信号通路较为复杂,可通过FhlA-RpoN或AtoC-RpoN途径调控靶基因表达。有8个含RpoN启动子序列的基因能与RpoN结合,其中LA1188、LA1968、氮代谢相关amtB基因表达受Fh1A-RpoN通路调控。Fh1A-RpoN通路还能间接调控OmpR表达。
【图文】：

结果显示，NAC预处理J774A.1和THP-1细胞在感染0.5 h后，细胞内出现入侵的病原菌体，0.5-8 h的感染过程中，ROS清除R嵲ご�理细胞与未处理细胞相比无显著性差异。A Time of infection (h)0.5 1 2 4 8J ■■■■■■■IHi!i ■■■■■■■■■■_■■■9

透射显微镜结果显示钩端螺旋体在感染ROS清除R嵲ご�理的细胞时并不影响细胞吞唾泡的形成，如停�

本文编号：2693074