Intermedin对大鼠肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤保护作用及机制的研究

发布时间：2020-06-03 00:49

【摘要】：垂体中叶素（Intermedin，IMD）是2004年新发现的内源性小分子多肽，属降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide, CGRP）超家族成员，具有多种生物学效应。本研究旨在对IMD在大鼠肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤（hypoxia/reoxygenation，H/R）中的保护作用及其机制进行探讨。分为以下两个部分：第一部分IMD通过抑制内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）诱导的细胞凋亡从而发挥对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧复氧损伤的保护作用实验一缺氧复氧损伤可诱导NRK-52E细胞内质网应激的发生目的：在大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E H/R模型中检测ERS经典分子的表达，探讨ERS在肾脏IRI中的作用；方法：常规培养肾小管上皮细胞NRK-52E，随机分为对照组（control）、缺氧复氧组（H/R）、衣霉素组（TM）；缺氧1h，复氧2h制作细胞H/R模型。流式细胞术检测细胞凋亡，Dapoxyl荧光染料染色检测细胞内质网形态，realtime-PCR法和Western blotting法检测ERS经典分子GRP78、CHOP、Caspaes12mRNA及蛋白表达。结果：⑴H/R处理可以导致肾小管上皮细胞NRK-52E凋亡，与正常对照组相比，H/R组和TM组细胞凋亡率显著增加，差别有统计学意义(P0.01)。⑵Dapoxyl染色结果可见对照组细胞内质网均匀分布在核周，无空泡出现。H/R可以导致内质网结构受损，Dapoxyl染料浓集，荧光强度增加，内质网颗粒感增强，荧光颗粒分布不均、浓集，并有空泡形成，其结果与TM组相同，说明H/R可以引起ERS。⑶Realtime-PCR及Western blotting结果证实，与对照组相比，H/R可导致ERS经典分子GRP78、CHOP、Caspase12mRNA和蛋白表达均显著上调（P0.01），H/R组与TM组无统计学差异。结论：在大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E H/R后，细胞凋亡率升高；内质网荧光染料浓集、颗粒感增强；ERS相关分子GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA及蛋白表达均上调，提示H/R损伤过程中存在ERS凋亡途径的活化。因此，减少过度的ERS有可能是成为肾脏IRI防治的新靶点。实验二IMD通过抑制内质网应激诱导的细胞凋亡减轻肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧复氧损伤目的：利用稳定表达IMD的NRK-52E细胞进行缺氧复氧实验，观察IMD对内质网应激的影响，探讨其细胞保护的分子机制。方法：肾小管上皮细胞NRK-52E，随机分为对照组（control）、缺氧复氧组（H/R）、空质粒组（H/R+pIRES2）、IMD组（H/R+IMD）。流式细胞术检测细胞凋亡，Dapoxyl荧光染料染色检测细胞内质网形态，realtime-PCR法和Western blotting法检测ERS经典分子GRP78、CHOP、Caspaes12mRNA及蛋白表达。结果：⑴IMD转染可显著降低NRK-52E细胞凋亡率，与H/R组相比，细胞凋亡率降低12%（P0.05）；而转染空质粒组与H/R组之间差异无显著性。⑵Dapoxyl染色可见，IMD转染可减轻内质网结构受损。⑶Realtime-PCR及Western blotting结果证实，与H/R组相比，IMD组ERS经典分子GRP78、CHOP、Caspase-12mRNA和蛋白表达均明显下降（P0.01），H/R组与转空质粒组间无统计学差异。结论：IMD可以通过下调大鼠肾小管上皮细胞H/R后GRP78、CHOP、Caspase-12的表达，抑制ERS及随后的凋亡信号通路，从而减少肾小管上皮细胞凋亡，减轻肾脏IRI。第二部分IMD对缺氧复氧后大鼠肾小管上皮细胞增殖作用的影响及其信号通路研究目的：在大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E H/R模型中研究IMD对H/R后细胞增殖、细胞周期的影响以及相关信号转导通路中蛋白表达的变化，阐明IMD促进肾小管上皮细胞修复及再生的机制及相关细胞信号转导通路。方法：肾小管上皮细胞NRK-52E，随机分为对照组（control），模型组：缺氧/复氧组（H/R组）、空质粒组（H/R+pIRES2）、IMD质粒组（H/R+IMD）、IMD质粒+PD98059组（H/R+IMD+PD）、IMD质粒+anisomycin组（H/R+IMD+anisomycin）。MTT法检测细胞增殖，分光光度法检测培养基上清LDH含量，流式细胞术检测细胞周期，realtime-PCR法和Western blotting法检测cyclin D1、cyclinE mRNA及蛋白表达，荧光素酶活性测定检测cyclin D1启动子活性，电泳迁移率实验（EMSA）测定AP-1位点的DNA结合活性，间接免疫荧光染色检测cyclin D1的亚细胞定位。结果：⑴与对照组相比，H/R组培养基中LDH含量显著上升，与对照组相比升高了106%。而IMD可显著降低培养基中LDH含量，与H/R组及空质粒组相比分别降低了33.85%、33.46%，差别有统计学意义（P0.01）；H/R组与转染空质粒（H/R+pIRES2）组无统计学差别。⑵MTT结果显示，H/R组NRK-52E细胞存活率较对照组明显下降，而IMD转染后细胞存活率提高（80.22±4.42%vs.59.77±9.63%, P0.05），差别有统计学意义（P0.01）；H/R组与转染空质粒（H/R+pIRES2）组无统计学差别。⑶H/R可使NRK-52E细胞p-ERK、p-JNK及p-P38活性水平增加，而IMD而进一步增加p-ERK的水平，下调p-JNK、p-P38的表达。⑷给予ERK抑制剂（PD098059）及JNK、p38通路诱导剂（anisomycin）后，各检测指标的变化如下：①PD98059抑制了ERK活性而减弱了IMD通过上调ERK表达对H/R后NRK-52E细胞增殖促进作用，同时培养液中LDH含量也较转染组增加；而anisomycin由于活化了JNK、p38活性，从而也从一定程度上减弱了IMD通过下调JNK、p38表达对H/R的NRK-52E细胞增殖促进作用及损伤保护作用。②细胞周期结果显示，与对照组相比，H/R组细胞G0/G1期比例增加，S期细胞比例降低（P0.05），说明H/R状态下NRK-52E细胞增殖受到抑制。与H/R比较，IMD组均表现为G0/G1期细胞比例显著降低，而S及G2期细胞比例增加（P0.05），说明IMD可使细胞越过G0/G1期，具有促进NRK-52E细胞增殖的作用。分别在NRK-52E中加入PD098059（ERK抑制剂）、anisomycin（JNK、p38诱导剂）后，PD098059、anisomycin可在一定程度上对抗这种作用。③real time-PCR及Western blotting结果显示H/R可增加cyclin D1、cyclin E的表达，这可能是一种损伤后启动修复的代偿机制，而IMD可进一步上调cyclin D1、cyclin E的表达，与对照组及H/R组相比具有显著性差异（P0.05）；PD098059、anisomycin可在一定程度上对抗这一上调作用。④cyclinDl荧光素酶报告基因分析结果显示，与对照组相比，H/R组细胞的cyclin D1启动子活性增加，而IMD可进一步上调cyclin D1启动子活性（与对照组相比，P＜0.05；与H/R组相比，P＜0.05）。PD098059（ERK抑制剂）、anisomycin（JNK、p38诱导剂）可在一定程度上对抗这一上调作用。提示IMD通过调控cyclin D1启动子的表达从而调控其表达。⑤EMSA结果显示，IMD可增加AP-1位点的结合活性显著上调，PD098059（ERK抑制剂）、anisomycin（JNK、p38诱导剂）可在一定程度上对抗这一上调作用。⑥免疫荧光检测结果可见，cyclin D1呈红色荧光，在NRK-52E细胞内主要表达在细胞核中，DAPI呈现蓝色荧光，pIRES2-EGFP/IMD携带EGFP报告基因，呈现绿色荧光。结论：在肾小管上皮细胞H/R模型中，IMD可以通过上调cyclin D1启动子活性及AP-1位点结合活性，增加cyclin D1、cyclin E蛋白表达，从而直接促进细胞周期进展，促进肾组织IRI后细胞增殖和修复。而这一作用至少部分是通过调节MAPK信号通路实现的。
【图文】：

光镜,细胞,胰酶消化,接触抑制

体外培养的正常 NRK-52E 细胞在倒置显微镜下，其形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞扁平多角形状，折光性良好，生长旺盛，细胞之间接触正常，紧密相靠，互相连接成片。细胞长满后呈接触抑制现象。H/R 后细胞折光性减弱，细胞不再透亮而变得灰暗，悬浮细胞数量进一步增加，细胞之间接触减少。见图 1.1-1。正常细胞（光镜×200）正常细胞胰酶消化后（光镜×200）ABCD

流式细胞术,统计学意义,博士学位论文,诱导细胞凋亡

山西医科大学博士学位论文之间接触减少。2流式细胞仪检测细胞凋亡结果H/R 处理可以导致肾小管上皮细胞 NRK-52E 凋亡，与正常对照组相比，H/R组细胞凋亡率显著增加，，差别有统计学意义，P<0.01；TM 处理组也可诱导细胞凋亡，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。（见表 1.1-2，图 1.1-2，1.1-3）。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【参考文献】