树突状细胞抗原递呈功能及其结构基础的研究

发布时间：2020-06-05 17:41

【摘要】：一．研究目的：本研究的拟建立成熟的、功能良好的DC细胞的培养体系，即：DC细胞形态典型、表达特征性的CD分子、能够诱导T淋巴细胞活化、增殖、亚群分化、分泌特征性细胞因子；研究DC细胞的超微结构并在纳米级水平上做进一步结构分析，用荧光探针寻找DC细胞成熟标志的CD分子(CD83、CD1a)、第二信号CD分子(CD86、CD80)和代表亚群来源的CD11c分子的表达位置，推测免疫应答的发生部位；观察免疫应答时DC细胞与T淋巴细胞的相互作用、形态学变化和Ca2+的动态变化。二、材料和方法： (一)主要试剂和设备： 1．试剂： AIM-V培养基、rhGM-CSF、rhIL-4、小鼠抗人FITC标记的CD86、HLA-DR、CD11c、Lin-1、CD4、IgG2a、CD45RA、CD69、Lin-1及小鼠抗人PE标记的CD83、CD86、CD80、CD3、CD123、CD40、CD4、CD25、CD28、CD45RO、IFN-γ和IL-4；小鼠抗人CD4-APC、CD8PE—Cy5、HLA-DR-percp、Mouse IgGl-PE和Mouse IgGl-FITC的MoAb；Annexin V-FITC／PⅠ双染法流式细胞分析试剂盒。 2．设备：二氧化碳电热恒温箱、流式细胞仪、Nikon倒置显微镜及相机、扫描电镜、透射电镜、原子力显微镜、共聚焦显微镜 (二)实验方法 1．对有无悬浮细胞的条件下，用含有rhGM—CSF 800~(?)／ml、IL-4 500~(?)／和TNF-α250~(?)／ml的无血清培养基，诱导培养DC细胞，并在光镜下每天记录形态学变化； 2．胞仪分析DC细胞Lin—HLA-DR+细胞群的CD83、CD1a、CD86、CD80、CD11c、CD123的表达情况； 3．胞仪分析DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69变化，进而分析CD4+T细胞的CD4／CD3、CD4／CD25、CD45RO／CD45RA、CD4／CD28亚群以及CD8+T细胞的CD8／CD3、CD8／CD25、CD45RO／CD45RA、CD8／CD28亚群比例的变化情况; 4.当DC细胞被抑制时，用RNAase抑制RNA、核酸染料PI标记细胞DNA，在流式细胞仪上分析在T细胞的周期变化; 5.流式细胞仪分析T细胞分泌的细胞因子IFN一Y和IL一4的情况，间接获悉T细胞的定向分化; 6.AnnexinV一FITC/PI双染法流式细胞分析试剂盒分析DC细胞递呈抗原后的凋亡情况; 扫描电镜和透射电镜分析DC细胞表面和细胞内的超微结构，寻找其结构特征; 7.利用AFM在纳米水平上进一步分析DC细胞的超微结构以及其与T细胞作用方式; 8.免疫电镜观察CD86的表达位置; 9.利用共聚焦显微镜分析DC细胞的特征性CD分子的表达情况，观察DC 细胞与T细胞的作用过程、DC细胞吞噬抗原的过程、DC细胞内游离CaZ十的变化过程以及DC细胞凋亡的过程三、结果: 1.光镜下见贴壁细胞在培养过程中(7天)逐渐长出长短不一树突状突起，细胞形态不一;电镜观察到DC表面呈多层“面纱”覆盖，有大量皱褶，“面纱”边缘有长短不一的不规则的树突状突起，每个突起有多级分枝;AFM见DC细胞的“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成的，各个DC细胞之间的突起相互连接，构成集落; 2.DC细胞表型在Lin--和HLA一DR+细胞群中，各CD分子表达的百分比为: CD123/54.5、CDlle/88.99、CD4O/56.65、CDla/69.36、CD86/92.57、 CDSO/70.79、CD83/85.91; 3.DC细胞递呈抗原后T细胞的CD69明显升高，CD4+CD69+/19.05%; CDS+CD69+/21，93%; 4.CD4+和CDS+的两组细胞的CD3+、CD25+、CD45RO+/CD45RA+的百分率均增高，CD28+的百分率和CD45RO一/CD45RA+的百分率均下降;CD4+/CD28- 和CDS+/CD28一的百分率亦升高; 5.DC细胞递呈抗原后，T细胞的S期细胞的比率从0.66%增加为7.21%; 而DC的死亡率和凋亡率，，分别由0.05%和0.00%升为6.95%和4.65%; 3 6.DC细胞含有丰富的线立体、微管和微丝系统;凋亡的DC细胞，其细胞核染色质固缩，内吞体严重扩张，细胞膜空泡化; 7.CD86分子主要聚集于胞体特定的区域内，突起部位表达较少，CD83和 CDla表达在细胞膜上，而CDllc则表达在细胞体部位; 8.羊抗小鼠IgG一F工TC分子随时间不同逐渐由细胞膜分布到整个DC细胞; 9.DC细胞递呈抗原后，CaZ+浓度升高，随即细胞破裂。四.结论: 1.该方法可以诱导出的成熟DC细胞，形态典型，而且少量悬浮细胞不影响DC细胞的分化和成熟;“面纱”状结构是由多级树突状突起相互缠绕形成，扩大了DC细胞的膜结构，是有效捕获抗原的结构基础; 2.DC细胞多个亚群可共存生长，绝大多数为MDC，而且成熟度高并表达丰富的双信号分子; 3.DC细胞具有吞噬功能，可以诱导T细胞活化、增殖，具有递呈抗原功育旨; 4.DC细胞递呈抗原后，在T细胞的作用下，DC细胞伴随细胞内CaZ十浓度的升高走向凋亡和死亡，且凋亡为非同步性。
【图文】：

图13图14三.结论:1.DC细胞的“慢”状结构系由树突状突起的多级分枝相互缠绕而成，AFM下这些“慢”状结构是由树突状突起的多级分枝有序排列形成的巨大的网;2.多枝细小的末级突起相互缠绕形成网的边缘;3.各种类型DC之间存在着结构上的连接;4.1个DC细胞可有多个淋巴细胞环绕接触，而1个淋巴细胞亦可接受多个DC细胞的多部位的接触，淋巴细胞被DC细胞的强大的网络所捕获;5.DC细胞的细小的突起与T淋巴细胞之间的绒毛状连接之间存在缝隙，为近距离“接触”(3nm)，是否属于缝隙连接形式的信号传递尚不清楚。四.讨论:AFM是在扫描电子显微镜的基础上发展的新一代显微镜。AFM具有0.01一0.Inm的分辨率，可以直接观测到原子水平，可以对原子、分子进行直接操纵，在自然的大气或液体条件下成像，是研究生物大分子表面拓扑结构、特别是局域结构的理想方法。利用AFM可以获取细胞膜和细胞器表面的结构信息及在不同环境条件下变化，以及与这种变化相关联的生物的生理过程的静态信息〔34〕。现在全细胞的AFM成像已经实现

体外培养,肿瘤抗原,树突状细胞

图2二.DC的来源及体外培养由于自体免疫细胞与异体树突状细胞之间由于存在着人类白细胞抗原(HLA)基因型不相合会引起强烈的排斥反应，且受者体内的T细胞不能识别供者树突状细胞上非匹配的HLA分子，无法诱导有效的CTL的增殖及抗肿瘤作用，因而必须是自体的树突状细胞才能作为肿瘤疫苗的负载体用于临床抗肿瘤治疗。目前用作瘤苗的树突状细胞来源有:骨髓、外周血和新生儿脐带血。三.Dc疫苗的种类目前，DC介导的疫苗主要有三大类:肿瘤抗原肚修饰的DC;细胞性肿瘤抗原修饰的DC;肿瘤抗原及细胞因子基因转染的DC，具体研究及应用将在各具体疾病中详细讨论，现仅概述如下。1.肿瘤抗原肤修饰的DC动物模型及人体临床试验已证明，肿瘤抗原肤(包括合成肤)或肿瘤细胞相关抗原与自身或同种异体的DC共育，DC与肿瘤表位肤结合之后可激发抗肿瘤CTL有效的抗肿瘤免疫
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R392

【参考文献】