基因工程重组乙型脑炎病毒E蛋白作为候选疫苗和诊断抗原的实验研究

发布时间：2020-06-07 00:56

【摘要】： 乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由蚊虫传播的引起人类或动物的中枢神经系统感染的病毒性疾病。在我国，JE每年的发病例数2～3万，其中约10％的患者死亡，且约15％的生存者有严重的神经后遗症。在亚洲，乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是病毒性脑炎的最主要病因。JEV依然严重威胁人类健康。由于JE病死率高，后遗症较重；灭活疫苗缺乏长效免疫，必须多次加强接种，费用较高，且有可能导致过敏反应；减毒活疫苗有毒力回复的潜在危险使其未能被国外接受，因此，新型JE疫苗的研制仍倍受关注。本教研室曾构建了3种重组JE疫苗：(1)重组杆状病毒在昆虫细胞Sf9中表达的携带JEV E蛋白的HIV-1 gag病毒样颗粒(VLPs)，(2)在果蝇细胞S2中表达的含JEV E蛋白的胞外颗粒(EPs)以及(3)以真核表达载体pVAX1为基础的含JEV PrM／E的DNA疫苗(pV／JE)。我们用小鼠模型比较评价以上3种疫苗诱发动物产生抗JEV细胞和体液免疫水平以及动物保护效果。BALB／c小鼠经2次接种疫苗后，测定其病毒特异性的CTL 第。军医人舍傅士研宛哇含位伶上活性、结合抗体、中和抗体及几V攻击保护实验。结果表明各新型疫苗组的CTL活性为33％～56％，灭活疫苗组为22％，而载体和PBS对照组的 CTL活性分别为17％和18％。一次免疫后，实验组小鼠血清结合抗体阳转率为90％。除DNA疫苗组外，各组小鼠的二次免疫血清抗体效价高于一次免疫的抗体效价（P＜0．05）。且以 VLPS ］Jl佐剂组小鼠血清抗体效价最高， EpS加佐剂组次之，均高于 pV／JE组和灭活疫苗组（P＜0．05）。以 JEV攻击小鼠后，实验组小鼠均无症状并全部存活。而载体PVAXI和P13S对照组各死亡3只，且对照组存活的小鼠均出现病毒性脑炎的症状。我们还用8从B八乳鼠评价0M疫苗对乳鼠的保护效果。2次接种mA 疫苗后，DNA疫苗组的叮L活性为 37．5％，而载体和 PBS对照组的叮I。活性分别为 18％和 8．5％。二次免疫后 DNA疫苗组的免疫荧光抗体滴度为 1：28．3（几何平均效价），抗体阳转率为孤％（8八0）：混合血清的中和抗体效价为1：40。以JEV攻击后，DNA疫苗组获得75％（6侣）的保护率，而对照组小鼠全部死亡。以上结果表明H种新型疫苗可以正确表达JliV的h 蛋白表位，可诱发免疫小鼠产生抗几V的中和抗体并有保护性作用，这些结果为JEV新型疫苗的研究提供重要的理论和实验依据。山于VLPS制备较繁杂，而且应用上可能有一定的危险性；D＼A疫茁的安全性问题目前还存在争议；果蝇细胞表达的EpS含量不够高。近年建立的巴斯德毕赤酵母表达系统具有糖基化适中、内源性蛋白分泌少、营养要求低、生长密度高等优点，己广泛应用于包括多种病毒抗原的外源蛋白的表达。为了分析巴斯德毕赤酵母系统表达JEV E蛋白的可行性，找们构建了 JEV E蛋白的真核表达载体并首次在毕赤酵母中表达。R”rl。CI｛扩增JEV E蛋白基因，克隆入真核表达载体PPICgK，并进行序列分析。表达质粒经电穿孔法转化酵母 SMD 68。用 MD平板筛选重组子、G4筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，SDS－I＞AGE和蛋白印迹分析表达产 4 ＄。fkkq4＋Rttq4deA 物。由于糖基化不同，结果显示所表达产物的相对分子质量约为 113 ti 78 kD，表达量约为50 mg／L。表达产物免疫动物后可产生中和抗体。我们首次在巴斯德比赤酵母中成功地表达了 JEV E蛋白，为制备基因工稚重组疫苗打下基础。山于目前治疗几无特效药物，可以用高滴度 JEV InAb快速中和病人血清中的病毒，降低死亡率和减轻后遗症的并发。但JEV mAb不能做为常规药物使用，必须确诊为JE后才能使用，所以早期确诊对该病的治疗起重要的作用。检测病人血清中 IEV gM抗体是重要的实验室诊断方法。出于JEV抗原制备过程的繁琐、潜在的危险性及缺少标准化，因此，基因工程表达的JEV E蛋白有望成为重要的实验室诊断抗原；非糖基化的 JEV E蛋白能否诱发免疫动物产生中和抗体和保护活性，报道不一，有必要进一步研究阐明。为了分析原核表达E蛋白的生物学特性，建立简便、快速的实验室诊断方法，我们构建了 JEV E蛋白的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。将 JEV E蛋白基因不同片段，克隆入大肠杆菌川 109构洼原核表达载体 pET《8a，重组表达质粒转化大肠杆菌队 “D3人经 l厂fG 诱导表达后，SDS－PAGE和蛋白免疫印迹分析表达产物。所表达的截短的［｛蛋白（EAB、EA、EB）的分子量分别约为 52、36、20 kD，表达量约占菌体总蛋白的 20～35％。ELISA结果表明，2I14和 2F2 mAb可以识别 E蛋臼＼端片段u＊，说明 JEV E蛋白 N端也含有中和表位。表达产物免疫动物可诱发中和抗体的产生。表达的E蛋白用于ELISA捕捉法检测5份儿 hH人血清 JEV gM抗体，结果为全部阳性。、IEV E蛋白在大肠杆菌中的成功表达，为制备JE实验室诊断抗原以及分析日蛋白基因结构与功能的关系提供了条件。
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R392

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