前列地尔对海水浸泡脊髓开放性损伤保护作用的实验研究

发布时间：2020-06-10 15:15

【摘要】：目的： 1.建立大鼠海水浸泡脊髓开放性损伤的动物模型，观察海水浸泡对脊髓开放性损伤大鼠早期神经功能及脊髓病理改变的影响，以评价模型的可靠性。 2.通过观察大鼠运动功能及运动诱发电位（MEP）的长期变化以及脊髓血流在一段时间内的改变，研究海水浸泡对脊髓开放性损伤大鼠脊髓功能的长期影响和对脊髓局部血流变化的作用，探讨早期应用Lipo PGE1静脉注射治疗对神经功能及脊髓血流的保护和改善作用。 3.通过对伤段脊髓标本神经细胞凋亡指数以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达情况的测定，研究海水浸泡对脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响及其机制，探讨早期应用Lipo PGE1静脉注射治疗的抗凋亡作用。方法： 1.第一部分实验成年健康雄性SD大鼠随机分为A组(假手术组)、B组（脊髓开放性损伤组）、C组（脊髓开放性损伤+生理盐水浸泡30min组）、D组（脊髓开放性损伤+生理盐水浸泡60min组）、E组（脊髓开放性损伤+海水浸泡30min组）和F组（脊髓开放性损伤+海水浸泡60min组）共六组。采用改良Allen’s重物坠落打击的方法造成大鼠SCI，各组分别于实验前及干预后3h、6h、12h、24h、72h六个时间点进行神经功能（BBB运动功能评分、Rivlin斜板试验）检测，并取伤段脊髓标本大体及HE染色显微镜下观察组织形态及病理学变化。 2.第二部分实验SD大鼠随机分为Sham组、SCI组、海水浸泡（SW）组及LipoPGE1组共四组。各组分别于术前、24h、72h、1w、2w、4w、8w七个时间点采用BBB评分、Rivlin斜板试验比较各组行为学之间差异；于损伤前、浸泡后0h、24h、72h、1w、2w、4w、8w进行MEP检测，观察潜伏期和波幅变化情况；于损伤前、损伤后0h、浸泡后0h、1h、2h、3h、6h、12h、24h、72h利用激光散斑衬比成像（LASCI）系统观察脊髓背侧血管血流变化情况。 3.第三部分实验SD大鼠依旧随机分为Sham组、SCI组、SW组及Lipo PGE1组共四组。分别于干预后3h、6h、12h、24h、72h、1w六个时间点用TUNEL法检测脊髓神经细胞凋亡情况，免疫组化SABC法检测Bc1-2、Bax蛋白的表达。结果： 1. SCI后各组大鼠BBB评分和Rivlin斜板试验功能角度值均显著下降，在72h之前各时间点E、F组与B、C、D组相比并未见明显差异，然而，在72h时间点，E、F组已明显低于B、C、D组，差异具有统计学意义，并且F组显著低于E组，相比之下，B、C、D组在BBB评分和Rivlin斜板试验功能角度值并未见明显差异；SCI后各组均出现脊髓水肿、出血、炎症及坏死等病理损害，单纯SCI组的上述病理损害在12h达到高峰，而海水浸泡组在3h、6h时病理损害相对较轻，但在12h、24h及72h时观察发现脊髓组织水肿、出血、炎症及坏死等病理损害迅速加剧，且在程度上已明显重于单纯脊髓损伤组及生理盐水浸泡组，并且浸泡60min较30min病理改变程度为重，而生理盐水浸泡组各时间点观察与单纯脊髓损伤组无明显差异。 2. SCI后各组大鼠BBB评分和Rivlin斜板试验功能角度值均显著下降，其后均有所恢复，但观察至8w与术前相比仍显著低下，SCI各组大鼠在24h时BBB评分和Rivlin斜板试验功能角度值未见显著差异，而72h~8w的各时间点SW组均显著低于SCI组，Lipo PGE1组均显著高于SW组及SCI组；SCI后MEP信号均消失，24h时可以再次记录到MEP信号，主要表现为潜伏期的延长，波幅的下降，其后各组均有所恢复，各组观察至8w其潜伏期和波幅均未能恢复至伤前水平，SCI各组大鼠在24h时潜伏期及波幅无明显差异，72h~8w的各时间点SW组与SCI组相比潜伏期均显著延长、波幅显著下降，而Lipo PGE1组潜伏期均较SW组及SCI组显著缩短，而波幅均显著增加；各组大鼠SCI后即刻血流速度均显著下降，且各组间无明显差异，然后，SW组和Lipo PGE1组按实验要求进行海水浸泡及给药，两组血流速度在浸泡结束后进一步下降，两组间血流速度无明显差异，而此时SCI组血流速度则略有恢复，且已明显高于上述两组，1h、2h时各组血流速度均有所恢复，1h时三组间血流速度间均具有显著差异，SCI组＞Lipo PGE1组＞SW组，，至2h时Lipo PGE1组的血流速度仅略低于SCI组，两者已无明显差异，但SW组改善缓慢，已显著低于上述两组，然而3h时各组血流速度再次下降，6h时SCI组及SW组血流速度继续小幅下降，而LipoPGE1组则明显改善，且已明显高于SCI组，三组间已有显著差异， Lipo PGE1组＞SCI组＞SW组，此后三组血流速度均继续恢复，观察至72h各组均未能恢复至损伤前水平。 3.各组大鼠脊髓在SCI后3h开始凋亡细胞均显著增加，并呈现上升趋势，各组凋亡指数（AI）均在24h达到最高，随后开始下降，至1w仍可检出较多的凋亡细胞（SW组＞SCI组＞Lipo PGE1组），在3h、6h时SW组和Lipo PGE1组AI无明显差异，并且均显著低于SCI组，而在其后的各时间点SW组则显著高于Lipo PGE1组和SCI组，且Lipo PGE1组显著低于SCI组；SCI后各组3h开始Bcl-2、Bax表达均显著增加，并呈现上升趋势，各组Bcl-2表达均在24h达到最高，而Bax表达均在12h达到高峰，随后均开始下降，至1w均仍有较高表达，SW组Bcl-2表达在各时间点均显著低于SCI组，而Bax的表达则比较特殊，在3h和6h时显著低于SCI组，而在其后的各时间点均显著高于SCI组；Lipo PGE1组在各时间点Bcl-2表达均显著高于SW组和SCI组，而Bax表达则均低于上述两组。结论： 1.海水浸泡脊髓开放性损伤大鼠模型稳定、可靠；海水浸泡可以使脊髓开放性损伤大鼠的神经功能恶化，并且浸泡时间越长影响越大；海水浸泡早期可以推迟并减轻损伤段脊髓水肿、出血、炎症及坏死等病理损害表现，但最终作用是使上述病理损害重于单纯损伤段脊髓。 2.无论是行为学观察还是神经电生理检测均证实海水浸泡可以对脊髓开放性损伤后的神经功能造成长期的影响，不利于其恢复；SCI后脊髓血流速度会显著降低，海水浸泡可以使损伤后的血流速度进一步减慢并延长其恢复时间；早期应用LipoPGE1静脉注射治疗可以改善海水浸泡脊髓开放性损伤后的神经功能及血流速度，并促进它们的恢复。 3.海水浸泡可以使脊髓开放性损伤后神经细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达上调，但是与单纯损伤大鼠相比，Bcl-2的表达较少，而Bax表达却明显较多，从而促进了神经细胞的凋亡；早期应用Lipo PGE1静脉注射治疗可以上调Bcl-2的表达、下调Bax的表达，从而起到抑制神经细胞凋亡的作用。
【图文】：

制作过程,后冲洗,消毒处理,开始记录

全部结束后冲洗创面，用 4-0 丝线逐层缝合切口并消毒处理皮肤。开始记录每只大鼠SCI 造模成功后的时间。（脊髓损伤模型制作过程见图 1-1。）图1-1 脊髓损伤模型制作过程

脊髓,标本,大鼠,无水酒精

共消耗4%的多聚甲醛约200ml，耗时约1小时。沿原手术切口剪开背部皮肤直至椎体，仔细游离并完整取出伤段及头尾段共1.0cm的脊髓组织，放入预盛有4％多聚甲醛的标本盒中固定24小时。（大鼠灌注取材过程见图1-2。）图1-2 大鼠的灌注及脊髓标本的取材2、标本包埋及切片制作（1）冲洗：将固定好的标本修剪好后自来水冲洗24h；（2）梯度脱水： 70%酒精24h→80%酒精24h→95%酒精12h→无水酒精Ⅰ2h→无水酒精Ⅱ2h；（3）组织透明：组织脱水后投入二甲苯：无水酒精（1:1）混合液30min→二甲苯Ⅰ15min→二甲苯 Ⅱ1 0min；（4）浸蜡：石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及包埋蜡放入烘箱中熔化备用，于50℃烘箱中进行
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R651.2;R-332

【参考文献】