MiR-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖影响及其机制

发布时间：2020-06-13 20:33

【摘要】：第一部分Hsa-miR-34a靶基因的生物信息学预测及分析 目的:为了估测和评价miR-34a的目的靶基因，我们通过在线生物信息网站，采用生物信息技术和计算机技术，从而获得hsa-miR-34a参与的转录后调控机制的信息。方法：以hsa-miR-34a作为检索词在miRGen数据库搜索，调取miRanda，PicTar及TargetScanS三种在线软件预测的交集，选出与细胞增殖密切相关的基因。结果：通过GO注释软件得到8个与肿瘤增殖相关的基因。NOTCH1参与细胞增殖等重要生理活动并且起了关键作用，因此我们分析可能的靶基因NOTCH1,发现NOTCH1基因的3′UTR段与miR-34a的有不完全互补序列，且在多物种有高度的保守性及较低的结合自由能。结论: miR-34a可能参与的多个目的靶基因的调控，NOTCH1很可能是miR-34a的一个靶基因。 第二部分miR-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖的影响 目的:探讨miR-34a靶向调控Notch1基因表达而对结肠癌SW480细胞增殖的影响。方法:通过生物信息学预测，Notch1为miR-34a特 异性靶基因。构建含miR-34a结合位点的Notch1基因3'-UTR域荧光 素酶报告载体。通过荧光素酶报告载体系统检测miR-34a与Notch1的3'-UTR相互作用对荧光素酶活性的影响；免疫印迹技术检测miR-34a对Notch1蛋白表达的影响。采用MTT法及流式细胞检测转染miR-34a对SW480细胞增殖的影响。结果:经过酶切及基因测序鉴定，Notch1基因3'-UTR序列的双荧光素酶报告重组质粒构建成功；并且miR-34a与Notch1的3'-UTR位点相结合。免疫印迹结果提示miR-34a负性调控Notch1蛋白的表达。miR-34a过表达后能抑制SW480细胞增殖。结论: miR-34a负性靶向调控Notch1基因的表达而抑制SW480细胞的增殖。 第三部分miR-34a靶向调控NOTCH1基因抑制肠癌SW480细胞增殖的分子机制研究 目的：探讨miR-34a靶向调控NOTCH1基因抑制SW480细胞增殖的分子机制。方法:SW480细胞分别使用NOTCH1基因的干扰质粒si(pLenti6-NOTCH1-shRNA)及对照（si-nc）进行转染；NOTCH1的表达质粒（pNL-NICD）和对照（nc）分别转染SW480-miR-34a细胞。Westernblot分别检测NOTCH1的干扰组和过表达组中NOTCH1及p53蛋白的表达水平。结果:相对于SW480组而言，pLenti6-NOTCH1-shRNA组能显 著地抑制NOTCH1基因的表达，其抑制率为43.94%(p=0.000)，而相应 的p53蛋白表达增加了82%(p=0.040)。而pLenti6组的NOTCH1与p53蛋白表达无明显差异。相对于SW480-miR-34a组而言，pNL-NICD组明显地增加NOTCH1基因的表达，其上升率为60.5%(p=0.000)，而相应的p53蛋白表达下降了48.1%(p=0.035)。而pNL组的NOTCH1与p53蛋白表达无明显差异。结论：miR-34a对SW480细胞的生长的抑制作用至少部分是通过靶向调控NOTCH1的表达，上调p53蛋白的表达水平实现的。 第四部分miR-34a对大肠癌SW480细胞在裸鼠移植瘤生长的影响 目的：探讨miR-34a对大肠癌SW480细胞对裸鼠移植瘤生长的影响及其分子机制。方法：在BALB/c鼠腋部皮下分别接种W480细胞、SW480-miR-34a细胞及SW480-control细胞，观察各组裸鼠的成瘤情况，通过测量肿瘤长短径来绘制生长曲线；通过测量移植瘤的重量计算抑瘤率。用HE染色观察各组瘤组织的形态学改变；用免疫组化法及免疫印迹法检测各组瘤组织中NOTCH1和P53的表达情况。结果:相对于种植SW480细胞组的裸鼠而言,种植SW480-miR-34a细胞组的裸鼠的成瘤速度明显减慢，且瘤体重量明显减少（F=1598,P 0.01），抑瘤率为73.60％，与种植SW480-control细胞组在成瘤速度和移植瘤的重量之间的差异无统计学意义（F=2.635,P=0.821）。HE染色显示：SW480-miR-34a细胞组的移植瘤的肿瘤细胞体积，核浆比例及核分裂相所占比例比SW480组和SW480-contrl组均明显缩小。免疫印迹及免疫组化显示：SW480-miR-34a细胞组的移植瘤中的NOTCH1的蛋白表达比SW480细胞组明显降低（P＜0.01），两者之间的差异具有统计学意义。而SW480-control细胞组的NOTCH1蛋白表达与SW480组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：miR-34a可以下调NOTCH1蛋白的表达来抑制结肠癌SW480细胞在裸鼠体内的生长。
【图文】：

1: Hsa miR 34a 与NOTCH1 3′ UTR 结合位点 ig 1: Binding sites for miR 34a and Notch1 3′ UTR bs 2:在多种脊椎动物的 NOTCH1 3′UTR 种子序列具有保守性.包括人类，大鼠，小鼠，兔，。白框代表保守序列。ig 2: Seed sequences of NOTCH1 3'UTR are conserved in vertebrate.including of human,ouse, mice, rat and canis.Wite rectangle was shown as the binding site

图 2:在多种脊椎动物的 NOTCH1 3′UTR 种子序列具有保守性.包括人类，大鼠，小鼠，兔，犬。白框代表保守序列。Fig 2: Seed sequences of NOTCH1 3'UTR are conserved in vertebrate.including of human,mouse, mice, rat and canis.Wite rectangle was shown as the binding site3 讨论microRNA(简称 miRNA)是一类由 18～24 碱基所组成的非编码单链的小分子RNA[9]。目前研究表明，miRNA 能够通过负向调控目的靶基因蛋白的表达，从而引起下游基因的表达的变化从而引起生物过程的发生变化。其主要机制是 miRNA 与靶基因 mRNA 的特异互补位点完全结合或不完全结合而导致目的靶 mRNA 的降解，从而在转录后水平或翻译水平抑制基因的表达[10,11]。大量研究显示 miRNA 参与了包括细胞分裂增殖、分化与发育以及代谢等许多重要的生物学过程[12-15]。目前研究miRNA 目的靶基因的方法主要包括实验途径[16,17]和生物信息学[18,19]途径，只有将两种途径有效结合，才能准确地发现 miRNA 的目的靶基因[20,21]。正是由于大部分的
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R735.3;R3411

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 邵新宏;于游;张才全;;miR-34a靶向调控NOTCH1基因对SW480细胞增殖的影响[J];第三军医大学学报;2012年22期

2 景黎君;贾永林;鲁晶晶;韩瑞;王舒阳;李尽义;彭涛;贾延R，

本文编号：2711705