志贺菌流行株Ⅰ类和Ⅱ类整合子的特征及与耐药性关系的研究

发布时间：2020-06-15 01:10

【摘要】： 近来的研究显示，革兰阴性菌中一种基因捕获和表达的遗传单位——整合子(integron)在细菌获得抗生素抗性机制中起了重要作用。整合子由整合酶(integrase)基因(intl)、整合酶特异性重组点attI和数目不定的基因盒(gene cassette)组成。基因盒往往由一个编码抗生素抗性的开放读码框(ORF)和一个整合位点attC组成。基因盒可从整合子中切除成为游离的环状分子，或者将外源基因盒捕获并整合入整合子。近些年临床上分离的志贺菌对以往临床常用的抗生素逐渐耐药，有的菌株甚至多重耐药。以往研究表明，结合性质粒在志贺菌耐药性形成起了重要作用。新近数起研究报道了志贺菌中Ⅰ类和Ⅱ类整合子与菌株耐菌性关系。本研究对杭州地区近年分离的福氏和宋内氏志贺菌株进行Ⅰ类和Ⅱ类整合子的检测，了解其分布特征；进一步通过克隆测序和Southenblot，确定其携带的基因盒组成特征以及其在基因组中的位置；在研究中发现了一种缺少3’保守区的非典型Ⅰ类整合子，通过反转PCR了解此整合子的切除基因盒的特征；并对非典型Ⅰ类整合子和Ⅱ类整合子各自携带的aadA赋予宿主菌链霉素抗性的不同能力，进行了探讨。本研究的64株宋内和福氏志贺菌中，63株分别于1998至2002年分离自杭州地区散发腹泻病人、暴发病人，1株分离自一起暴发事件的水源。 1．典型Ⅰ类整合子的分布及一级结构特征典型的Ⅰ类整合子包括有5’保守片段(intI1)、可变基因盒区(引物inF～inB)和3’保守片段(引物qacEΔ1～sul1)。本文64株福氏和宋内志贺菌株中，三者均阳性浙江大学博士学位论文的菌株仅有6株，阳性率为9.4%。对其可变区测序分析，其中2株宋内志贺菌I 类整合子均携带1个基因盒，为氨基糖昔腺营酞基转移酶(aminoglycoside adenylyltransferase)AZ基因(aa朔2)，编码对链霉素的抗性。另2株宋内志贺菌I类整合子携带2个基因盒，分别紧邻5’保守区依次为二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase) Al型基因(咖月I)和氨基糖昔腺普酞基转移酶Ala基因是(a adAla)，以及二氢叶酸还原酶A17型基因(动讨I乃和氨基糖昔腺昔酞基转移酶Ala基因(aa咖习。 1株福氏志贺菌y变种携带的基因盒类型与其中一株宋内志贺菌相同，为护汉17和 aad减万。1株福氏6型志贺菌携带一个dfrV基因盒。分别提取2株携带典型I类整合子的宋内志贺菌株基因组DNA和质粒DNA(其中基因组DNA经B“mHI和Pst I限制酶切)，琼脂糖凝胶电泳后，intll探针Southenblot结果显示典型整合子是位于质粒上的。 2.非典型I类整合子的分布及一级结构特征在检测典型I类整合子过程中，发现了30株intll阳性，但可变区阴性、3’ 保守区阳性仅有3株(阳性率为5.1%)，推测福氏志贺菌株中可能广泛存在着某种非典型I类整合子。选择此类菌株分别提取基因组DNA和质粒DNA(其中基因组 DNA经BamHI和Pstl限制酶切)，琼脂糖凝胶电泳后，intll探针SOuthenblot结果显示提示此intll是位于细菌染色体上的。将其中CIOI一1株基因组DNA中intll 阳性的BamHI和Pstl限制酶切段(3 .4 kb)克隆至载体pUC19上(此质粒称为 puc一C101)，并进行核酸序列测定。序列分析表明此插入片段依次由intll基因、 attl位点以及blaoxA_30和aadAI基因盒组成，典型I类整合子3’保守区部分被一段插入序列151所替代。2个ORF分别编码p内酞胺酶OXA一30和氨基糖普腺昔酞基转移酶Al。应用扩增此型基因盒区的引物intl Ica一F和引物15 Ica一R，对本文所有菌株进行 PCR扩增，结果30株intll阳性的无典型I类整合子的志贺菌株中(1株宋内志贺菌，29株福氏志贺菌)，29株扩增出相同长度的PCR产物，而6株携带典型I类整合子的志贺菌和其余28株intll阴性的志贺菌均未扩增出阳性条带(见表l)。结果表明，此29株intll阳性志贺菌株有着相同的基因盒区，我们将之称为志贺菌非典型I类整合子(intll和intH一151同时阳性);福氏志贺菌中此非典型I类整合子总浙江大学博士学位论文检出率高达84.8%(28/33)，尤其是福氏2a和2b中均为100%(13/13和9/9):宋内志贺菌中则较低，为3.2%(l/31)。非典型I类整合子阳性菌株中氨节青霉素抗性的阳性率分别为100%(21/2l)，而其他非典型I类播合子阴性菌株中为51.9%(14/27)。 3.非典型I类整合子的基因盒切除模式我们使用反转PcR在携有pUC一c101的大肠埃希菌过夜培养肉汤煮沸物中检测到了游离基因盒的存在，并发现了aadAI基因盒与blaoxA-30基因盒连锁的切除模式。结果表明，此非典型I类整合子是功能性的。 4.H类整合子分布及其一级结构特征通过检测n类整合子intIZ基因，结果发现H类整合子在宋内和福氏志贺菌中分布广泛，阳性率分别达80.6%(25/31)和87.9%(29/33)。进一步研究表明11类整合子是位于染色体上的。提取intIZ阳性的宋内志贺菌C202株的基因组DNA，将一条含intIZ的去斤”d m限制酶切段(10.7 kb)克隆至载体pUC19上(此
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R378.25
【图文】：

可变区,PCR扩增,图谱,宋内志贺菌

的菌株仅有6株，阳性率为9.4%;其中宋内志贺菌4株、福氏志贺菌6型1株及福氏志贺菌y变种1株(表1、表3)。此6株菌典型I类整合子可变基因盒区的PCR扩增图谱见图5。对其可变区扩增产物核酸序列分析表明，共有4种基因盒类型，模式图见图3A，序列详见图6。其中2株宋内志贺菌(C103一1株和yhOZ一25株)I类整合子均携带1个基因盒，为氨基糖昔腺昔酞基转移酶(aminoglyeosideadenylyltransferase)AZ基因(aa“2)(见图3A、表3)，编码对链霉素的抗性;但此2株菌株(C103一1株和yhoZ一25株)对链霉素的纸片法药敏试验结果均为敏感(表3)。另2株宋内志贺菌(外02一26株和yh31株)I类整合子携带2个基因盒，yh02一26株中紧邻5’保守区依次为二氢叶酸还原酶(diliydrofolatereductase)Al型基因(护月!)和氨基糖普腺昔酞基转移酶Ala基因是(aa喇Ia)(见图3A、表3)，分别编码对三甲氧节二氨啼睫(trimethoprim

志贺菌,株基,质粒DNA

分别提取携带典型I类整合子的宋内志贺菌株Clo3一1株和yhOZ一26株基因组DNA和质粒DNA(其中基因组DNA经B“mHI和Pstl限制酶切)，琼脂糖凝胶电泳后，intll探针Southenblot结果显示(图7中的第7和第8泳道)，二者在基因组DNA和质粒DNA中均有阳性条带出现，因提取的基因组DNA中包含有质粒DNA，此结果提示志贺菌C103一1株和yh02一26株中的典型整合子是位于质粒上的。图7志贺菌株基因组DNA和质粒DNA的intllsouthenbot结果A:基因组DNABamHI和Pstl酶切后的凝胶电脉图谱B:质粒DNA的凝胶电脉图谱C:基因组DNABamHI和Pstl酶切后的intl]Southenbot结果D:质粒DNA的intl!Southenbot结果Lanel一12:依次为宋内志贺菌株e202(intll阴性)、C199一2(intl!阳性)和108(intll阴性)、福氏Za志贺菌株C17s一l(int，l阳性)和elol一l(int，l阳性)、福氏Zb志贺菌株yh02一29(intll阳性)、携带典型I类整合子宋内志贺株Clo3一1和yh02一26、intll阴性的宋内志贺菌株yhoZ一加和yhoZ一21、intll阴性的福氏2a型志贺菌株301和携带有pUC一C202的大肠埃希菌DHSQ。LaneM:Marker(人DNAHindlll)。

【参考文献】