人层粘连蛋白α4链LG1-3组件的研究

发布时间：2020-06-20 08:41

【摘要】： 人层粘连蛋白α4链于1994年发现，其染色体定位于6q21，有39个外显子，长122kbp。其开放阅读框架为5448bp，编码1581个氨基酸，主要分布在来源于中胚层的组织，如内皮基底膜、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞，也在上皮基底膜处存在，如表皮、唾液腺、胰脏、食管、肠陷窝、肾皮质小管、胃腺。α4链是laminin-8(α4β1γ1)和laminin-9(α4β2γ1)的亚基之一，在骨骼肌毛细血管，α4链在E11期出现，持续到成年期，α4链的生物学功能迄今仍不太清楚，在人类的疾病和异常反应中没有发现和α4链有关，但是α4链在发育中的微血管处广泛和特异性表达提示α4链可能参与了血管生成作用。α4链基因敲除小鼠的皮下组织和肌肉广泛性出血，从而导致贫血、微血管广泛性出血、运动缺陷，电镜下观察到微血管结构受到破坏，毛细血管的基板不连续，这些事实说明α4链在新生毛细血管基底膜的形成和结构的完整性方面有非常重要的作用。在脑部肿瘤如多形性成神经胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤α4链过表达，这可能成为神经胶质瘤的诊断指标之一。研究表明层粘连蛋白的G结构域和诸如整和素、等细胞受体及其它的细胞外配体间的相互作用对于基底膜的完整性非常重要；可以介导整和素依赖性的细胞粘附，在脑部肿瘤如多形性成神经胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤细胞转移和侵袭中有重要作用。为了研究LG1-3组件的晶体结构、LG1-3结构域的生物学功能，本实验进行了如下工作：层粘连蛋白α4链LG2组件基因的原核表达通过RT-PCR扩增了576bp的LG2组件的cDNA，将其重组到克隆载体和原核表达载体，构建了克隆质粒pMD-LG2和原核表达质粒pET-LG2，以BL21(DE3)为宿主菌，在IPTG诱导下表达了重组的26kDa LG2蛋白，利用SDS-PAGE的方法初步纯化了重组的LG2蛋白，SDS-PAGE检测为单一条带，为LG2-3单克隆抗体的筛选提供了抗原。层粘连蛋白α4链LG2-3组件单克隆抗体的制备为满足检测重组LG1-3之需要，通过RT-PCR扩增了层粘连蛋白α4链1266bp的LG2-3组件cDNA，构建了LG2-3组件的克隆质粒pMD-LG2-3和真核表达质粒pVAX-LG2-3。通过基因免疫的方式用真核表达质粒pVAX-LG2-3免疫BALB／c小鼠，通过常规的细胞融合，间接ELISA筛选和有限稀释克隆，建立了1株杂交瘤细胞株CF12，CF12单克隆抗体对重组表达的LG2有特异性反应，随后进行了使用CF12单克隆抗体对胎儿肾脏、小肠、大动脉进行的免疫组化研究结果表明，在肾小管的基底膜、肾小球囊细胞膜、小肠浆膜、平滑肌及毛细血管内皮、小肠绒毛上皮细胞、大动脉血管内皮细胞膜均出现阳性反应，本实验结果和文献报道一致，从而证明了通过基因免疫制备的单克隆抗体的特异性。层粘连蛋白α4链LG1-3组件基因在Pichia pastrois中的表达通过RT-PCR扩增了α4链1800bp的LG1-3组件cDNA，构建了其克隆质粒pMD-LG1-3。通过体外定点突变，经过三次 PCR将位于 LGI－3组件 960hp处的 SaCI酶切位点 GAGCTC突变为 GAGCGC，构建了SQC酶切位点突变的LG司组件基因的克隆质粒pMD－MLG13和酵母表达质粒 pPICZ－MLG13，pPICZ－MLG13经 Sacl线性化后通过电转化将 LGI－3组件基因整和到毕赤酵母GSlls细胞染色体上，利用PCR和表型筛选筛选到7株整和LGI．3组件基因的毕赤酵母GSlls细胞，在甲醇诱导下，经SDS．PAGE和Westffo blot检测到了LGI－3组件基因的表达。本实验获得的人层粘连蛋白 a 4链 LGZ－3单克隆抗体和 LGI－3重组蛋白为进一步深入研究LGI．3的结构和功能间的关系奠定了基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军军需大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：R346
【图文】：

晶体结构,层粘连蛋白,片层,组件

介导的细胞粘附，其中的两个肤(AG一10、AG一32)片层，二者在重组的QILGI一5中时均不和Q6p蛋白受体是。一dystrogiycan，后者借助跨膜蛋白glycan和层粘连蛋白的E3片段、laminin.2、基底99)19]。。一dy‘troglycan和laminin一l的E3片段的，。一勿stroglycan结合于层粘连蛋白的位点和同位置，但利用位于G爪、胀、N“N片层的其，而且既然这种结合是钙依赖性的，所以。ILG4ohenester等1999)[71。aZLe一3、aZLo4一5和烈的多，单独的LG组件不相结合，仅QZLG3过点突变确定了。ZLGS参与和。一dystroglycanari眺ulfatied结合没有明显的相关性(Hohenester结合aILG4·5，而不是aZLol一3及aZLGI一3，[61的只有。2链LG组件的串联形式才能和a

区块,结构域,组件,层粘连蛋白

由二硫键来稳定。5、IH、V结构域在laminin一1短臂上的m、V区域由一系列3一8个EGF样LE组件组成(如图5)，电镜下W、W、VI球状结构域被杆状的结构域隔开。层粘连蛋白的LE组件和典型的EGF8

【相似文献】