神经营养因子和骨骼肌对DRG神经元生长的调节作用

发布时间：2020-06-26 13:09

【摘要】：骨骼肌(skeletal muscle, SKM)同时接受运动和感觉神经元的支配,肌梭是一种感受本体感觉的感受器。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)是初级感觉神经元的胞体聚集形成的,这些神经元形成中枢部和外周部,在外周神经末梢和脊髓之间建立感觉联系。体外培养的神经元和肌细胞是目前研究神经肌-接头(neuromuscular junction, NMJ)的形成、功能及其维持作用的重要手段之一,这种模式还用来研究神经-肌功能紊乱、细胞信号转导、药物筛选以及生物机器人的研发等。以往的研究认为,感觉神经元只是简单的跟随运动神经元到达其相应的靶组织,并且感觉神经元轴突的生长伴随运动神经元且晚于运动神经元。但有研究证实,感觉神经元有能力凭借自己的力量到达靶组织而不必借助运动神经元的引导。这表明感觉神经元在最初的轴突生长的过程中对于靶组织的选择或识别具有明显的可塑性。神经营养因子(neurotrophics, NTs)是神经系统正常发育和功能维持的重要调节因子。神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)是NTs家族中的成员,外源性给予这些营养因子可以促进已损伤的神经元的修复和轴突的再生。神经和肌之间NTs和一些分子的交换是神经-肌连接进行信息传递的物质基础。神经元和靶组织之间各种因子的释放和接受是两者之间相互作用、相互影响、相互依存的意义所在。NTs和靶组织SKM细胞对神经元功能和神经-肌连接的维持具有重要作用。神经元一旦识别到合适的靶组织,就会建立特定的神经元和靶组织之间的联系,这些联系的建立包括突触生长动力学的调节以及功能性连连接的形成。因此,本课题利用DRG与SKM细胞进行联合培养,观察DRG神经元与靶组织SKM之间建立联系即形成神经-肌连接的过程,研究在各种实验条件下,靶组织SKM和NTs对DRG神经元生长的调节作用。第一部分靶组织骨骼肌对器官型培养的DRG神经元生长和迁移的影响神经元和靶组织之间存在着相互依存的关系。在神经元的发育过程中,神经元延伸它的轴突到达相应的靶组织,神经元一旦与其支配的靶组织建立了联系,便开始依靠靶组织的存活而存活,并由靶组织提供营养支持。当然,神经元本身有其自身的生存、发育和代谢过程,但靶组织对神经元的存活所起的作用是毋庸置疑的。有研究证实,在胚胎发育期,如果失去肢芽的营养作用,感觉神经元将出现支配紊乱的现象,甚至关去存活的能力而走向程序性细胞亡(programmed cell death, PCD)。外源性给予SKM提取物或肌球蛋白-2,可以促进神经元的存活和感觉神经元轴突的分支。有研究显示,靶组织的炎症可以抑制已损伤的神经元的轴突再生。也有研究显示,鞘细胞中的多种细胞成分可以产生营养因子促进神经元的存活和轴突的生长。生长相关蛋白43(growth-associated protein-43, GAP-43)作为一种神经元特异性的钙结合蛋白和肌动蛋白结合蛋白在突触前膜有高表达。GAP-43常被用来当作突触生长发育和神经损伤后的神经再生的标志物。感觉神经肽在DRG神经元表达水平的高低代表DRG神经元的功能状态变化,其中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是由降钙素基因逆转录生成的一种神经肽,它可在DRG神经元表达,并发挥多种生物学功能,可参与多种感觉信息的调节,并且与肌的活力、血管舒张及炎症反应等功能的调节有关。神经丝(neurofilament, NF)是神经元特异性中间丝,高分子量神经丝(highmolecular mass neurofilament, NF-H)对正常神经元的维持发挥重要作用,神经丝蛋白-200(neurofilament-200, NF-200)属于NF-H。随着神经元的成熟,NF-H的出现是决定轴突稳定性的重要细胞内事件。DRG神经元可根据神经生化免疫反应分为神经肽免疫反应(neuropeptide-immunoreactive, NP-IR)和神经丝免疫反应(neurofilament-immunoreactive, NF-IR)神经元两种主要表型。NP-IR神经元的突起构成无髓鞘的和薄髓的痛觉传入纤维,这种纤维主要分布于皮肤和内脏, CGRP-IR神经元可代表NP-IR神经元；NF-IR神经元的突起构成有髓神经纤维,这些神经纤维主要分布于肌梭,NF-200-IR神经元可代表NF-IR神经元。靶组织SKM对DRG神经元生长和神经元表型的变化产生影响的作用及其机制目前仍不清楚。因此,本课题利用器官型DRG和分散SKM细胞联合培养,研究靶组织SKM对DRG神经元突起的生长、神经元的迁移、GAP-43、CGRP和NF-200的表达变化。本实验选取新生Wistar大鼠(出生后24h以内),在无菌条件下取四肢的SKM,经消化、离心、过滤后,制成单细胞悬液,种植于包被过多聚赖氨酸的24孔培养板内,进行SKM细胞的分散培养,培养3d至SKM细胞开始出现融合时,取孕15d(embryonic day15, E15) Wistar胚胎大鼠的DRG,在体视显微镜下剥去神经节外膜后,种植于多聚赖氨酸包被的24孔培养板内或种植于已种植了SKM细胞的培养板内,继续培养6d后,进行各种实验研究。根据实验设计,将培养的标本共分为两组：(1)DRG与SKM细胞联合培养组：器官型DRG组织块与分散SKM细胞联合培养；(2)DRG单纯培养组：器官型DRG组织块单独培养。用倒置相差显微镜动态观察不同培养条件下DRG神经元与SKM细胞的生长状态,终止培养后用扫描电子显微镜技术(scanning electron microscopy, SEM)、免疫荧光双标技术、Western blot分析技术和realtime-PCR分析技术对不同培养条件下DRG神经元进行检测,得到以下实验结果。 (1)器官型DRG组织块单独培养或与分散SKM细胞联合培养6d后,以DRG组织块为中心,取右上1/4象限进行神经纤维束计数,发现联合培养环境下DRG神经纤维束的数目明显高于单纯培养环境中的DRG,并且联合培养中的DRG的神经纤维束可生长到更远的距离。 (2)器官型DRG组织块单独培养或与分散SKM细胞联合培养6d,终止培养后经SEM观察,联合培养环境下由DRG组织块生长出的神经纤维束,与单纯培养的DRG相比不仅数目明显增加,而且神经纤维束更加粗壮。联合培养中由DRG组织块迁出的神经元数目,与单纯培养的DRG相比明显增多,而且迁移的距离较大,有的可达0.5mm以外。联合培养中,由DRG组织块生长出的神经纤维可跨越多个肌管表面,在肌管表面形成密集的神经纤维网,有的神经纤维终末呈末端膨大终止于周围的肌管表面。联合培养中,由DRG组织块迁出的单个神经元分散于肌管之间,并发出突起越过或终止于肌管表面。 (3)用微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein2, MAP-2)进行免疫荧光标记由DRG组织块迁出的神经元,在荧光显微镜下定量计数发现,联合培养的DRG组织块迁出的神经元明显多于单纯培养的DRG。 (4)对迁出的神经元进行MAP-2和GAP-43、CGRP或NF-200免疫荧光双标记,发现联合培养中DRG迁出的GAP-43-IR神经元和NF-200-IR神经元的比例明显高于单纯培养中的DRG,而CGRP-IR神经元的比例则没有变化。 (5)经Western blot和real time-PCR (?)分析发现,联合培养的DRG内GAP-43和NF-200及其mRNA的表达均显著增加。以上结果显示,在器官型DRG和分散SKM细胞联合培养中,由DRG组织块生长出的神经纤维以及由DRG组织块迁出的神经元生长出的神经突起均可与肌管之间形成神经-肌连接样结构。联合培养中,靶组织SKM可促进DRG神经元的生长与迁移,而且能促进NF-IR神经元表型的表达,而对NP-IR神经元表型的影响作用不明显。这表明联合培养中,DRG神经元和SKM之间不仅具有形态学上的神经-肌连接的建立,而且靶组织SKM对DRG神经元的促生长作用及特定表型的影响向作用表明DRG神经元与SKM之间具有功能性的相互作用关系。第二部分神经营养因子对DRG神经元与骨骼肌联合培养中生长相关蛋白-43表达的影响对NTs敏感的神经元所支配的靶组织对神经元的存活和分化有重要作用。有研究证实感觉保护可以通过调节SKM内NTs的合成,从而提供一个良好的微环境。靶组织可以调节感觉神经元的功能和表型。在轴突再生的过程中,GAP-43选择性的表达在发育中的神经元的轴突。周围神经损伤后,GAP-43在损伤的神经和DRG内都有表达。在培养的DRG神经元,NGF和BDNF等NTs可以影响GAP-43的表达,GAP-43对生长锥的形成和轴突的生长发挥重要的作用。具有靶组织联系的DRG神经元,与没有靶组织联系的DRG神经元相比,其生长过程中的可塑性变化可能是不同的。各种NTs是否对具有靶组织联系的DRG神经元GAP-43的表达产生调节作用目前仍不清楚。本课题利用分散的DRG神经元与SKM细胞进行联合培养,研究NGF、BDNF和NT-3对DRG神经元GAP-43表达的影响作用。本实验利用新生Wistar大鼠(出生后24h以内)四肢的SKM,经消化、离心、过滤后,制成单细胞悬液,种植在包被过多聚赖氨酸的培养板中,进行SKM细胞的分散培养,培养3d,SKM细胞开始出现融合时,取E15Wistar大鼠胚胎的DRG,经消化、离心和过滤后制成单细胞悬液,接种于含有SKM细胞的培养板内,根据实验设计分为4组：(1)NGF组：用NGF(终浓度为10ng/ml)孵育6d；(2)BDNF组：用BDNF(终浓度为10ng/ml)孵育6d；(3)NT-3组：用NT-3(终浓度为10ng/ml)孵育6d；(4)对照组：不施加任何干扰因素,继续在培养液内培养6d。终止培养后,用SEM、免疫荧光双标技术、Western blot分析技术和real time-PCR分析技术等各种实验手段进行检测,得到以下结果。 (1)SEM观察显示,与对照组相比,经NGF、BDNF和NT-3孵育的联合培养标本,单个DRG神经元发出的突起数目较多,从1～5个不等,在单层分散的SKM细胞表面形成纤维网,有的突起在行程中有膨体样结构,有的突起末端变细,有的突起的末端会出现膨大样改变,终止于SKM表面。 (2)免疫荧光双标记、Western blot和real time-PCR分析结果显示,与对照组相比,经NGF、BDNF和NT-3孵育的联合培养标本,GAP-43-IR神经元的比例、GAP-43蛋白水平及GAP-43mRNA水平显著增加。以上结果表明,外源性NGF、BDNF和NT-3可对分散的DRG神经元与SKM细胞联合培养中神经元突起的生长具有明显的促进作用,这种作用可能与GAP-43的表达上调有关。外源性NGF、BDNF和NT-3对DRG神经元突起生长的促进作用可能与特定的NTs改善DRG神经元再生的微环境有关。不同的NTs对不同亚群的DRG神经元的特定影响作用尚有待于进一步探讨。第三部分NGF或NT-3对DRG神经元与骨骼肌联合培养中PPT、CGRP、NF-200和MAP-2mRNA表达的影响特定的NTs除了促进DRG神经元生长以外,还可能会影响DRG神经元多种神经递质的合成和蛋白的表达。P物质(substance P, SP)和CGRP均为在DRG神经元表达的肽类神经递质,与血管的舒缩活动和感觉信息的传递有关。NF-200属NF-H,对正常神经元功能的维持有重要作用。MAP-2短暂性参与神经元的生长和细胞极性的形成,与微管、NF和肌动蛋白相互作用,来维持神经元细胞骨架的稳定性。为了进一步检测特定的NTs对DRG神经元内这些物质表达的影响作用,本课题利用分散的DRG神经元与SKM细胞进行联合培养,研究NGF和NT-3对DRG神经元内编码SP的前速激肽原(preprotachykinin, PPT) mRNA、CGRP mRNA、NF-200mRNA和MAP-2mRNA表达的影响作用。实验中细胞联合培养的步骤与第二部分相同。根据实验设计分为3组:(1)NGF组:用NGF(终浓度为10ng/ml)孵育6d；(2)NT-3组：用NT-3(终浓度为10ng/ml)孵育6d;(3)对照组：不施加任何干扰因素,继续在培养液内培养6d。终止培养后,用real time-PCR技术检测PPT、CGRP、NF-200和MAP-2mRNA表达。结果显示,NGF和NT-3均可促进联合培养中DRG神经元PPT、CGRP和NF-200mRNA(?)的农达,而对MAP-2mRNA的表达没有明显的影响作用。NGF和NT-3对联合培养中DRG神经元PPT和CGRP mRNA表达的促进作用表明特定的NTs可促进DRG神经元肽类感觉神经递质的发育或成熟；NGF和NT-3对联合培养中DRG神经元NF-200mRNA表达的促进作用表明特定的NTs与DRG感觉神经元发育晚期的细胞内事件有关;NGF和NT-3对联合培养中DRG神经元MAP-2mRNA表达无显著影响表明DRG神经元本身或靶组织SKM细胞存在的影响足以触发MAP-2mRNA的表达,而不依赖于外源性特定NTs的存在。NGF和NT-3对联合培养中DRG神经元内多种神经肽和蛋白mRNA表达的促进作用反映了DRG感觉神经元对特定NTs的反应性。这对进一步研究在不同条件下或状态下,特定的NTs对DRG感觉神经元可塑性变化的影响作用提供了新的实验依据。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R338.1

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