人和鼠era基因的功能研究

发布时间：2020-06-30 18:38

【摘要】： era基因是1986年测定大肠杆菌基因组序列时发现的一个开放读框。后来的大规模基因组研究表明，它广泛分布于生物界。Era蛋白的N端是一个典型的鸟苷酸结合蛋白结构域，与其它G蛋白有较高的同源性；C端含有一个RNA结合功能结构域—KH结构域。这种独特的C端使Era蛋白有别于其它所有G蛋白而独立成为一个新的G蛋白亚家族。研究这种从细菌到人类高度保守的新G蛋白家族成员对于探索自然并发现规律具有重要意义。 我的研究工作可以分为两个部分。1、利用酵母双杂交钓取人Era蛋白的结合蛋白。2、利用RNAi技术封闭人和鼠era基因在相应细胞中的表达，观察细胞发生的变化。 首先我们以hEra蛋白作为诱饵蛋白，从人era基因表达较高的胎肝cDNA文库中，筛选得到了15个候选作用蛋白。其中A19候选作 ＄·f’＾f4＊f’．＾ 用蛋白片段上包含了一个 NTR／C345C domain，这个结构域能与 metz。nclns结合。Metzincins就是h离子依赖的一类金属蛋白酶。鉴 于陈南春高级实验师钓取的细菌Era结合蛋白YggG就是一种Zn离子依 赖的金属蛋白酶，所以我们把A19蛋白片段做为重点分析对象，做了体 外GST－pulldown实验。结果表明，hEra蛋白在GTP存在情况下可以和 NTR／C345C domain结合。hEra蛋白和叶R／C345C domain相互作用的初 步结果为我们进一步研究提供了方向和线索。 另外我们还利用自行构建的专门用于RNAi的ShRNA表达载体，在相 应细胞内降低了人和鼠era基因的表达。细胞生长曲线结果表明，人和 鼠era基因的表达下调，可以引起“S”形生长曲线右移；透射电镜结果 也显示，人和鼠era基因的表达下调后，绝大部分细胞都出现在分裂前 状态。然而，却很难看到处于分裂相的细胞；流式细胞议结果表明，GZ州 期细胞周期阻滞。 透射电镜还观察到era基因RNA干涉以后，人和鼠来源的细胞都 出现了多核仁的改变。KH domain突变体转染细胞后，电镜观察也出现 了同样的结果。核仁是rRNA前体生物合成的位置。这就表明era基因 参与了rRNA基因转录。
【学位授予单位】：中国人民解放军第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q343
【图文】：

BOx一B·BOX一C、Box一D)，与真核Ras蛋白及其它G蛋白均无同源性。1999年，Chenx.等仁6，’〕完成了大肠杆菌Era蛋白的晶体结构分析。在结晶体中，Era蛋白以二聚体的形式存在(图1)，每个Era蛋白单体图1大肠杆菌E咒蛋白晶体三维结构示意图FiglOverallstruetureof五eoljEra(dimerintheerystal)的空间结构相同，可分为两个结构域:N端结构域在氨基酸序列和空间结构上都是一个典型的GTPase结构域;C端结构域则为Era所特有的空间结构，其中含有一个pa二p折叠，paap折叠中的两个螺旋形成HTH(helix一七urn一helix)结构，HTH的转角处含有KH结构域的保守序列VIGxxGxxIK。KH结构域是进化上相当保守的一段序列，存在于许多RNA结合蛋白中，如K蛋白(hnRNP成分)〔8〕、FMRI(fragileXmentalretardationgene产物)〔

如果将DNA一BD与己知的诱饵蛋白质X融合，构建出BD一X质粒载体;AD基因则与cDNA文库、基因片段或基因突变体(以Y表示)融合，构建出AD戎质粒载体(见图3)。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。该酵母菌株含有特定报告基因(如LacZ，H工S3，LEUZ等)，并己经去除了相应转录因子的编码基因，因此本身无报告基因的转录活性。蛋白质X和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS18

【引证文献】

相关博士学位论文 前1条

1 黄勇;Era及其相互作用因子功能研究[D];第四军医大学;2007年

本文编号：2735675