狼疮伴动脉粥样硬化小鼠模型中TLR4介导的免疫应答及干预效应研究

发布时间：2020-07-01 06:14

【摘要】：研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病，目前认为其发生、发展可能与自身免疫性炎症相关。系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus， SLE)是典型的自身免疫性疾病，患者AS相关性心脑血管疾病的发生率和死亡率显著增高。近年来，有不少研究认为高迁移率族蛋白（high-mobility group box protein l, HMGB1）、Toll样受体（toll-likereceptors， TLRs）是促进AS及SLE发生、发展的关键分子。但有关HMGB1-TLRs轴在SLE伴发AS中的具体免疫发生机制，尚未明确。研究目的本实验采用ApoE-/-小鼠腹腔注射降植烷，建立红斑狼疮伴发AS模型，分析主动脉斑块HMGB1、TLR4受体及下游主要信号分子表达差异，并用Toll样受体4（TLR4）基因特异性RNA干扰（RNAi），进一步探讨TLR4信号在SLE伴发AS小鼠模型中的免疫病理机制，以期为深入AS的自身免疫性炎症机制及其潜在治疗新靶点提供理论依据。方法 1.有效封闭TLR4基因表达的RNA干扰慢病毒载体的构建及筛选：用筛选出的TLR4-shRNA，转染小鼠平滑肌细胞株，荧光显微镜观察GFP表达强度，实时定量PCR检测各转染细胞TLR4mRNA表达水平，筛选出有效阻断TLR4表达的小分子干扰RNA载体。 2．动物模型建立及实验方案 apoE-/-小鼠和B6小鼠随机分为apoE-/-+降植烷组(AS)、apoE-/-+生理盐水对照组(A)、B6+降植烷组(S)，B6+生理盐水组(C),各组小鼠在高脂喂养12周后，再分为颈动脉置管亚组、TLR4干扰亚组和不处理亚组，继续高脂喂养12周。 3.病理学观察：主动脉树整体染色、头臂干动脉斑块连续切片，左肾动脉石腊切片，进行HE、油红、免疫组化/荧光染色等染色，观察如下指标：（1）慢病毒转染效率:荧光显微镜观察斑块及肾组织GFP的表达，实时定量PCR分析TLR4mRNA的表达；（2）新生内膜形成：观察颈动脉置管后诱发的新生内膜形成情况；（3）免疫组化分析腹主动脉血管外膜BAFF的定位表达；腹腔巨噬细胞原代培养油红染色分析脂质吞噬功能；（4）斑块负荷：en face油红染色分析主动脉树斑块数目与大小、斑块的面积百分比；（5）斑块易损性：分析斑块脂质、巨噬细胞、胶原纤维、和平滑肌细胞含量，计算易损指数：易损指数=(巨噬细胞+脂质)阳性面积百分比／(平滑肌细胞+胶原)阳性面积百分比；（6）普鲁氏蓝染色染色观察斑块内出血等发生情况，TUNEL染色分析斑块内细胞凋亡程度。（7）肾组织HE染色观察肾损伤情况及IgG、C3免疫荧光染色评估肾免疫复合物沉积。 4．分子生物学观察（1）Western blot检测：取主动脉组织，提取蛋白质，Western blot检测斑块内HMGB1、TLR4、IRF3、MyD88、TRIF、NF-κB蛋白表达。（2）实时定量RT-PCR检测：取新鲜颈动脉斑块组织，提取RNA，实时荧光定量RT-PCR反应检测斑块内TLR4、IL-4、IL-12、IFN-β、MCP-1和TNF-α mRNA的表达水平。（3）自身抗体抗ds-DAN、抗Sm抗体滴度及血脂水平的测定采用ELISA检测ds-DAN、抗Sm抗体滴度、生物化学方法测血胆固醇、甘油三酯水平。结果 1.TLR4mRNA基因表达沉默率达89.5％。 2.降植烷促进颈动脉套管后新生内膜的生成：AS-p组内膜厚度是A-p组的1.25倍，而S-p组内膜是C-p组的1.55倍。 3.烷诱导血管外膜BAFF高表达，同时腹腔巨噬细胞吞噬功能增强。 4.AS组斑块占主动脉表面积的百分比是A组的1.83倍，TLR4阻断治疗后，AST组斑块负荷降低了26.5%， AT组斑块负荷降低了29.6%。 5.降植烷影响斑块易损性：AS组、A组、AST组和AT组易损指数分别为3.41±0.44，2.71±0.38，2.13±0.25，1.38±0.19，差异有统计学意义。 6.降植烷加速斑块内出血：AS空载体组斑块内出血发生率为40.5％，明显高于A组2.0%、降植烷促进斑块凋亡：AS组空载体组小鼠无名动脉斑块内TUNEL阳性细胞比例显著高于A组(41.8±3.9%vs24.9±3.1%)。采用RNAi治疗后，与相对应的空载体组相比，AST组和AT组斑块内TUNEL阳性细胞比例分别降低了22.2%、29.3%。 7.降植烷及apoE基因敲除加速肾脏组织损伤及免疫复合物沉积，AS组血清中抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体水平均明显高于C组、A组和S组，且AS组较S组升高更显著（P0.05）。与C组空白对照组比较，A组中ds-DNA抗体、S组抗Sm抗体增高，组间比较，差异有统计学意义。但A组抗Sm抗体、S组中ds-DNA抗体，与空白对照组比较，血清滴度有增高趋势，但差异无统计学意义。而降植烷对血脂无明显影响。 8.WB示降植烷不同程度上调主动脉组织HMGB1、TLR4、 MyD88与TRIF， NF-κB与IRF3表达。 9.主动脉TLR-4、TNF-α、MCP-1、IFN-β、IL-4、IL-12mRNA在AS组明显增高，RNA干扰治疗后，显著降低。结论 1.降植烷可加速apoE-/-小鼠颈动脉套管诱发的新生内膜形成，增加斑块负荷及斑块不稳定性，导致腹主动脉外膜BAFF，增加斑块凋亡； 2.apoE基因敲除协同降植烷导致anti-ds-DNA、anti-Sm自身抗体增加，肾IgG及C3沉积； 3.主动脉HMGBI-TLR4-MyD88-NF-κB通路活化是导致SLE中AS加速的分子机制，本研究结果为深入探讨AS新的发病机制及潜在治疗途径提供了新的理论依据。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R593.24;R543.5;R-332

【共引文献】