钩端螺旋体外膜蛋白血清学诊断价值和CTB-OmpL1疫苗免疫保护作用评价

发布时间：2020-07-07 15:00

【摘要】：背景与目的： 以问号钩端螺旋体为代表的致病性钩端螺旋体广泛分布于热带、亚热带和温带地区，引起的人兽共患病称为钩端螺旋体病，简称钩体病。该病是我国重点防控的传染病之一，目前常用诊断钩体病的方法和应用的疫苗存在各自的缺点。近年的研究表明，外膜蛋白是钩体外膜中的重要组成部分，其中多种组分具有致病性和免疫原性。本研究为提高血清学检测的敏感性和特异性，克隆、表达LipL21, Loa22,LipL32和LigACon4-8，并以这4种重组蛋白为抗原，建立检测马和狗血清中相应抗体的ELISA和狗血清中相应抗体的LUMINEX法，为研制诊断钩体病的新血清学检测方法奠定实验基础。应用分子生物学方法，构建CTB-OmpL1重组乳酸菌口服疫苗，并利用仓鼠模型评价其免疫保护作用，为研制新型疫苗奠定基础。 研究内容与方法： 1.采用PCR方法，从钩端螺旋体基因组DNA中分别扩增LipL21,Loa22, LipL32和LigACon4-8基因片段，构建原核表达载体LipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21， LigACon4-8 PET28/Rosetta，大量诱导表达重组菌，运用Ni+NTA及正负离子吸咐柱纯化获得重组蛋白,用Wester blot鉴定。 2.以重组蛋白LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8为抗原，建立检测马血清和狗血清中相应抗体的ELISA，用建立的ELISA检测大量临床马血清和狗血清并与传统MAT比较，评价其诊断价值。 3.以重组蛋白LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8为抗原，建立检测狗血清中相应抗体的Luminex法,检测大量临床狗血清中相应抗体,并与传统MAT比较，评价其诊断价值。 4.用基因工程技术，克隆、表达钩端螺旋体重组蛋白CTB-OmpL1，转入乳酸菌中制备CTB-OmpL1口服疫苗；制备仓鼠钩体感染动物模型，通过该模型评价该口服疫苗的免疫保护作用。 结果： 1.成功构建了重组表达质粒LipL21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGEX4T2/BL21， LigACon4-8-PET28/Rosetta，双酶切鉴定基因完整，基因测序结果表明与Genebank基因序列基本一致，表达重组菌后获得2-5mg/ml浓度，纯度达90%以上的高浓度的纯化蛋白。Wester blot结果显示重组蛋白能与感染钩体的马和狗血清发生反应。 2.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原建立的ELISA检测130例MAT阴性和176例MAT阳性马血清,对马血清检测结果，其敏感性分别可达84.66%，77.84%，77.84%，82.39%，特异性达83.85%，92.31%，86.15%，86.15%。 3.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原与203例MAT阳性，102例MAT阴性狗血清作ELISA检测，其敏感性分别可达99.5%，89.7%，92.6%，97.5%，特异性达84.3%，81.4%，84.3%，84.3%。 4.用LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8重组蛋白为抗原建立了检测狗血清中相应抗体的Luminex法，检测了203例MAT阳性，20例MAT阴性狗血清，其敏感性分别可达89.66%，75.86%，82.27%，78.33%，特异性达85.0%，80.0%，90.0%，80.0%。 5.构建了重组CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗，建立了钩体感染的仓鼠动物模型；口服疫苗免疫仓鼠后可产生较好的免疫保护较果，攻毒后免疫仓鼠存活率可达87.5%。 结论： 成功表达LipL21, Loa22, LipL32和LigACon4-8，获得高纯度的重组蛋白，均具有良好的抗原性。成功建立了检测马和狗血清中钩体抗体的ELISA，成功建立了检测狗血清中钩体抗体的Luminex法，经检测大量马与狗的临床血清标本，具有较高的敏感性和特异性。钩体重组CTB-OmpL1乳酸菌口服疫苗在仓鼠模型中表现出较好的免疫保护效果。为研制诊断钩体病的新血清学检测方法奠定实验基础。成功构建了CTB-OmpL1重组乳酸菌口服疫苗，经仓鼠模型评价具有较好的免疫保护作用，为研制新型疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【图文】：

图 1.1 目的基因 PCR 扩增图Fig.1.1 PCR products for target geneM: DNA marker; 1: LipL21; 2: Loa22; 3: LipL32 4: LigACon4-8质粒的测序L21-PET28/Rosetta, Loa22-PET28/Rosetta, LipL32-PGE PET28/ Rosetta，进行测序分析，所得序列与 Geneba Loa22, LipL32 和 LigACon4-8 比对后可见一致率分别达结果见图 1.2-图 1.5。

图 1.2 LipL21 在 LipL21-PET28/Rosetta 中测序结果Fig.1.2 LipL21DNA sequence in LipL21-PET28/Rosetta

29图 1.3 Loa22 在 Loa22-PET28/Rosetta 中测序结果Fig.1.3 Loa22DNA sequence in Loa22-PET28/Rosetta

【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 张连英;丁朋晓;杨正久;谭立志;;钩端螺旋体外膜蛋白的研究概况[J];中国医药科学;2013年09期

2 ;A Sensitive and Specific IgM-ELISA for the Serological Diagnosis of Human Leptospirosis Using a rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2 Fusion Protein[J];Biomedical and Environmental Sciences;2011年03期

3 姜久昆;严杰;;钩端螺旋体主要外膜蛋白在诊断和疫苗研制方面的进展[J];中国人兽共患病学报;2008年06期

本文编号：2745263