神经干细胞Ankrd17蛋白和MCMV嗜神经蛋白M122相互作用与胎脑发育异常机制

发布时间：2020-07-12 14:25

【摘要】：【目的】 1.构建能表达小鼠Ankrd17基因的小发卡RNAs（shRNAs）慢病毒载体，为选择性沉默Ankrd17基因在神经干细胞（NSCs）中的表达奠定基础； 2.研究神经干细胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其增殖、分化功能和凋亡的影响，为明确MCMV致神经系统损伤机制提供新的思路和依据； 3.研究神经干细胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其Wnt信号通路相关分化基因表达的影响，以明确Ankrd17分子与MCMV嗜神经蛋白M122的相互作用与胎脑发育异常机制的关系。 【方法】 1.构建重组干扰序列载体质粒：将含Ankrd17基因siRNA序列的DNAoligo退火形成双链DNAoligo，再将该双链DNAoligo连接到BSAI酶切的pBSilence1.2线性化表达质粒载体上。将连接好的产物转入到制备好的细菌感受态细胞，通过对长出的克隆菌落进行提取质粒和SacI酶切和测序鉴定，即得到成功转染的菌株命名为pBSi/U6-Ankrd17； 2.构建重组慢病毒载体质粒：将正确克隆的质粒pBSi/U6-Ankrd17用Lipofectamine2000转染至小鼠源性的视网膜血管内皮细胞，经PCR鉴定筛选有效靶点。根据筛选的有效靶点基因序列设计合成shRNA-Ankrd17片段。通过将慢病毒载体质粒pLVX-shRNA2-m用PstI和BamHI进行双酶切反应后，将shRNA-Ankrd17的稀释退火产物与之连接，构建重组慢病毒载体质粒pLVX-shRNA-Ankrd17，通过DNA测序进行鉴定； 3.制备载体慢病毒：在慢病毒包装系统LentiviralPackingMixture的帮助下将pLVX-shRNA-Ankrd17载体共转染至293T细胞，收获并浓缩所得到的的慢病毒上清，即为最终的慢病毒颗粒（Lenti-Ankrd17shRNA）储存液，用逐孔稀释法测定病毒滴度； 4.检测RNAi效率：用Lenti-Ankrd17shRNA慢病毒液感染胎鼠神经干细胞，通过荧光显微镜观察荧光表达情况来判断最适感染条件，并通过Real-TimePCR检测Lenti-Ankrd17shRNA对NSCs中Ankrd17基因的干扰效率； 5.后续实验分组：①慢病毒干扰+MCMV感染组；②MCMV感染对照组；③慢病毒干扰对照组；④正常对照组；每组设3复孔； 6.用CCK-8法检测神经干细胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其增殖的影响； 7.用流式细胞术检测神经干细胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其分化的影响； 8.用PI染色法检测神经干细胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其凋亡的影响； 9.用Real-TimePCR方法检测神经干细胞Ankrd17基因沉默后MCMV感染对其Wnt信号通路相关基因（wnt1,wnt3,wnt7a,ngn1,ngn2,c-myc和cyclinD1）表达的影响。 【结果】 1.重组干扰序列载体构建：测序结果表明，目的基因Ankrd17成功插入到载体质粒pBSilence1.2中，成功构建pBSi/U6-Ankrd17克隆载体，且与目的序列完全一致； 2.重组慢病毒载体质粒构建：PCR反应显示克隆正确的3个载体质粒均可扩增出Ankrd17基因产物，通过Real-TimePCR成功筛选出有效干扰靶点pBS1.2Ankrd17-1载体质粒；酶切及测序结果表明，成功构建重组慢病毒载体质粒pLVX-shRNA-Ankrd17，与目的序列完全一致； 3.载体慢病毒制备：成功制备出表达Ankrd17基因shRNA的慢病毒颗粒浓缩液，病毒滴度为1.0×108TU/mL； 4.选择性沉默效率：荧光显微镜下观察发现，NSCs在转染慢病毒颗粒5d后，在MOI=5并添加5μg/ml的polybrene的转染条件下转染效率最好，Real-TimePCR结果显示，与空病毒组和正常细胞对照组相比，pLVX-shRNA-Ankrd17-1可以明显降低NSCs中Ankrd17表达水平，其沉默效率达到67.3%； 5.细胞增殖：与MCMV感染对照组相比，慢病毒干扰+MCMV感染组的细胞增殖活性明显升高（p0.05）； 6.细胞分化：分化培养3d后，慢病毒干扰组nestin的表达水平明显高于正常对照组（p0.05），而GFAP和NSE的阳性比率亦明显低于正常对照组（p0.05）。而慢病毒干扰+MCMV感染组在分化培养第3d时，其GFAP和NSE的阳性细胞率明显高于感染对照组（p0.05）； 7.细胞凋亡：MCMV感染组NSCs的凋亡率在感染后第5d明显高于正常对照组（p0.05），慢病毒干扰组中在第3d起凋亡率明显高于正常对照组（p0.05），而慢病毒干扰+MCMV感染组的细胞凋亡率始终明显高于感染对照组（p0.05）。 8.Wnt基因表达：在慢病毒干扰组，Wnt1的表达量在第1d和第3d时明显低于正常对照组，而第5d时又显著升高（p0.05），Wnt3和Wnt7a在分化培养第5d时高于正常对照组（p0.05）；慢病毒干扰+MCMV感染组的Wnt1表达则呈逐渐上升趋势，在感染后第3d和第5d明显高于感染对照组（p0.05），而Wnt3和Wnt7a的表达从感染后第1d到第5d始终高于感染对照组（p0.05）。 9.Ngn基因表达：慢病毒干扰组的Ngn1表达始终低于正常对照组，Ngn2基因在第1d和第3d时表达水平稍低于正常对照组，第5d时则明显高于正常对照组（p0.05）；而慢病毒干扰+MCMV感染组的Ngn1表达却明显高于感染对照组（p0.05），其Ngn2表达亦始终高于感染对照组。 10.c-myc和cyclinD1基因表达：慢病毒干扰组c-myc基因的表达水平始终低于正常对照组，cyclinD1在第1d和第3d时表达量稍低于正常对照组，第5d时开始上升，明显高于正常对照组（p0.05）；而在慢病毒干扰+MCMV感染组的c-myc表达在感染后第3d和第5d显著高于感染对照组（p0.05），其cyclinD1基因除在第1d时稍高于感染对照组外，在感染后第3d和第5d均低于感染对照组。 【结论】 1.成功构建了小鼠Ankrd17基因shRNA慢病毒载体pLVX-shRNA-Ankrd17；该慢病毒载体可以有效沉默胎鼠NSCs的Ankrd17基因； 2.选择性沉默神经干细胞Ankrd17基因后，MCMV感染对NSCs的增殖活性和早期NSCs分化的抑制程度明显减弱，并导致NSCs的凋亡比率增高； 3.选择性沉默神经干细胞Ankrd17基因可部分减轻MCMV诱导的NSCsWnt信号通路分化相关基因wnt1，wnt3，wnt7a，ngn1和ngn2以及c-myc的表达异常，并下调cyclinD1表达水平； 4.MCMV嗜神经蛋白M122蛋白可通过与神经干细胞Ankrd17分子相互作用，干扰NSCs的Wnt信号通路分化相关基因表达进而抑制NSCs的增殖和分化，这可能是先天性CMV感染所致胎脑发育异常的重要机制之一。 【目的】 研究大蒜新素对人巨细胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纤维（HELF）细胞后即刻早期基因、早期基因和晚期基因表达的影响，探讨和明确大蒜新素抗HCMV效应的机制。 【方法】 选择HCMV在增殖周期中主要表达即刻早期基因ul123和ul122（分别编码IE72和IE86蛋白），早期基因ul54（编码UL54蛋白）和晚期基因ul83（编码pp65蛋白）作为靶序列设计特异性引物，同时用GAPDH基因作为管家基因，建立实时荧光定量PCR系统来检测HCMVul122，ul123，ul54和ul83mRNA水平的时序性动态变化。实验分组：①大蒜新素处理HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF细胞组（大蒜新素处理组），大蒜新素剂量为9.6μg/ml（2.28倍IC50浓度）；②HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF细胞对照组（HCMV感染对照组）；③更昔洛韦（GCV）处理HCMVAD169毒株（MOI=2.5）感染HELF细胞对照组（GCV处理组），GCV剂量为2.3μg/ml（2.28倍IC50浓度）；正常HELF细胞为阴性对照。用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞感染后0.5h、2h、4h、6h、12h和24h时间点HCMV的ul122、ul123、ul54和ul83基因在转录水平的动态变化。 【结果】 1.大蒜新素对HCMVul122基因表达的影响：HCMVAD169株ul122mRNA在感染后2h表达量已明显增高，随后逐渐增长。两种药物处理组ul122mRNA的表达量在感染后2h～24h均低于同时间点病毒感染细胞组，但GCV处理组在感染后0.5h～24h与病毒对照组水平相当（p0.05）。大蒜新素对AD169ul122mRNA表达的抑制率在感染后0.5h～24h各时间点分别是21.3%，36.1%，40.8%，47.3%，60.2%和75.2%，抑制效应在感染后24h最强。 2.大蒜新素对HCMVul123基因表达的影响：HCMVul123mRNA的表达规律同ul122，在感染后2h表达量明显升高，之后持续增高。大蒜新素处理组ul123的表达量始终明显低于感染对照组（p0.01），且大蒜新素对ul123mRNA表达的抑制程度随时间延长而增强，在感染后24h抑制率达到70.4%，而GCV组则与病毒感染组比较无明显差异（p0.05）。 3.大蒜新素对HCMVul54基因表达的影响：ul54mRNA在感染后4h开始表达量明显增多（p0.05），之后持续增加。两种药物处理组ul54mRNA表达量始终低于病毒对照组（p0.05）。大蒜新素和GCV对ul54mRNA表达的抑制率在感染后24h分别为45.4%和27.2%。 4.大蒜新素对HCMVul83基因表达的影响：ul83mRNA在HCMV感染后6h开始表达明显增多（p0.05），感染后12h～24h表达量持续上升。在感染后12h～24h两种药物处理组ul83mRNA表达量明显低于病毒对照组（p0.05），大蒜新素和GCV对ul83mRNA表达的抑制率在感染后24h分别为45.9%和26.2%。 【结论】 1.大蒜新素可显著抑制HCMVAD169毒株IE基因（ul122和ul123）的转录过程，导致其mRNA表达明显降低，抑制率在感染后24h可达到75.2%和70.4%；对E基因（ul54）和L基因（ul83）转录水平亦有所抑制，抑制率在感染后24h分别为45.4%和45.9%，表明HCMV的IE基因可能是大蒜新素抗HCMV作用的主要环节。 2.GCV对HCMVAD169毒株IE基因没有明显的抑制作用，对ul54和ul83在感染后24h抑制率分别为27.2%和26.2%，表明GCV抗HCMV的作用机制主要在于抑制病毒DNA聚合酶。 3.大蒜新素和GCV对HCMVAD169相关基因的抑制效应不同与其作用位点不同有关。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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本文编号：2752086