水通道蛋白3与人皮肤成纤维细胞光老化的机制研究

发布时间：2020-07-13 22:18

【摘要】：摘要：水通道蛋白3(Aquaporin3, AQP3)是一种能快速跨膜转运水、甘油和尿素等小分子物质的膜整合蛋白,在皮肤的屏障功能、水的保存中起重要作用。AQP3不但参与细胞的增殖、分化与迁移,与皮肤细胞的衰老相关,而且还能够通过调节H202的透膜吸收,进而影响细胞内的信号传递网络。 自噬是细胞内主要的异化途径,维持细胞稳态,参与衰老以及与衰老相关的各种生理病理过程。但随着年龄的增长,细胞内自噬功能逐渐减弱,导致细胞适应外界环境和自身防御反应的能力降低,细胞稳态发生变化。细胞光老化过程中,UVA辐射细胞产生的ROS可诱导自噬及细胞衰老,而衰老的细胞中,自噬功能减弱,ROS对细胞造成的损伤得不到清除而不断积累,进一步加重细胞衰老。而H2O2作为ROS的重要组成成分,可被AQP3跨膜转运,由此,我们推测：AQP3与自噬在NHSFs光老化过程中可能存在某些联系。 本研究的第一部分中,我们首先采用组织块真表皮分离法原代培养正常人皮肤成纤维细胞(NHSFs),利用320-400nm波长范围的UVA辐射NHSFs,构建光老化细胞模型。再行慢病毒转染AQP3shRNA和AQP3cDNA质粒,成功构建不同AQP3表达量的NHSFs稳定细胞株。最后行β-半乳糖苷酶染色、Western-blot (WB)和RT-PCR等技术检测衰老相关指标及光老化过程中AQP3水平的变化；行透射电镜、免疫荧光染色(IF)以及Western-blot等技术检测自噬水平。研究发现：(1)小剂量UVA单次辐射NHSFs,不能诱导细胞衰老,但AQP3表达增高；小剂量UVA重复5天辐射NHSFs,可诱导细胞衰老,此时AQP3表达下降；(2)降低表达AQP3的NHSFs出现衰老表型,接受小剂量的UVA单次辐射可加重衰老；而过表达AQP3可使NHSFs在接受小剂量UVA重复5天的剂量辐射时的衰老减轻；(3)小剂量UVA单次辐射NHSFs,细胞自噬水平增高；小剂量UVA重复5天辐射NHSFs,白噬水平下降；(4)降低表达AQP3的NHSFs,自噬水平降低,小剂量的UVA单次辐射可使自噬水平进一步降低；而过表达AQP3,使NHSFs的自噬水平增加,在接受小剂量UVA重复5天的剂量辐射时的亦可减轻自噬水平的降低。该部分研究初步明确了,AQP3通过影响细胞自噬,在人皮肤成纤维细胞光老化过程中的发挥保护性作用。 为进一步明确AQP3通过影响自噬参与细胞光老化过程的具体机制,在第二部分的研究中,我们利用前期构建的光老化细胞模型和稳定转染的细胞株,使用H2O2抑制剂,以及三条MAPKs途径中各磷酸化蛋白分子的抑制剂,检测了细胞内H2O2水平,以及ERK1/2／、JNK/SAPK、p38MAPK及mTOR磷酸化水平/总蛋白水平以及LC3Ⅱ/Ⅰ和P16INK4a的蛋白表达水平。研究发现：(1)低表达AQP3的NHSFs,胞内H2O2水平增加,低剂量UVA单次辐射即可使胞内H2O2水平进一步升高,H2O2抑制剂可显著降低其水平；(2)高表达AQP3可显著减少NHSFs在接受低剂量UVA重复5天辐射时升高的胞内H2O2水平,H2O2抑制剂亦可降低其胞内H202水平；(3)抑制剂降低胞内H2O2水平后,可使MAPKs的JNK/SAPK、P38MAPK、ERK磷酸化水平下降；(4)分别抑制三种MAPKs磷酸化后,只有JNK/SAPK、p38MAPK抑制剂诱导了LC3Ⅱ/Ⅰ水平增高,P16INK4a表达下降。说明,三条MAPKs途径中只有JNK/SAPK、p38MAPK途径参与了AQP3调节自噬和影响光老化的过程；而AQP3介导的H2O2的跨膜转运,是活化MAPKs途径的重要因素。 综上所述,我们得出如下结论：UVA辐射NHSFs诱导的胞内H2O2聚集可激活MAPKs途径进而影响自噬和衰老,AQP3可通过调控H2O2的跨膜转运,减轻MAPKs的活化,实现对自噬水平的调节,从而抵御NHSFs衰老。即：AQP3可通过影响ROS-MAPKs-mTOR途径调节自噬,从而在人皮肤成纤维细胞光老化过程中发挥保护性作用。本研究首次将AQP3引进皮肤衰老机制的研究领域,也是首次发现AQP3可通过影响自噬水平延缓细胞光老化衰老进程。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R339.11
【图文】：

不同剂量UVA福射NHSFs，衰老表型的鉴定23

剂量UVA单次福射人皮肤成纤维细胞，诱导AQP3表达增高5J/cm^x5d UVA福射NHSFs，AQP3表达下降（图2a, b)；而SJ/cmbVA辐射NHSFs,AQP3的表达增强（图2a，b)。IF结果可见：正常NHSFs的AQP3主要表达于胞膜及胞质中；5J/c:m2UVA福射NHSFs后48h，AQP3的胞團表达与正常NHSFs比较明显增强（PcO.OOl)；而5J/cm2x5d UVA福射NHSFs后48h，AQP3的膜菜表达均不清晰，较正常NHSFs显著减弱（P<0.01)。[■】 [d】A0P3 —！-}0:00] … 口 NHSFSp-actin 棚^ mmm mmm | - i2kD ；抑- tMOd Kid x2d a4d iSd ^ 60-c "T-|6] 5 40- It **! 1 二 20' 1 —.GAPDH 一452bp ￡！ ^~ ？ 0N""“一I~I一"I~I~’~.~匕AOP^ Zlvvp 、 、 XA。P3 JSWtitr' xld x2d z3d >4d x5d\C]图2不同剂量UVA福射NHSFs后AQP3的表达水平2.2.2改变AQP3的表达量对人皮肤成纤维细胞形态和生长活性的影响2.2.2.1 NHSFs-AQP3shRNA. NHSFs-AQP3cDNA的转染效果鉴定NHSFs-virus和NHSFs-virus’分别与正常对照组NHSFs比较；NHSFs-AQP3shRNA 组与 NHSFs-virus 组比较；NHSFs-AQP3cDNA 组与NHSFs-virus'比较。WB 结果显示：NHSFs 组、NHSFs-virus 组、NHSFs-AQP3shRNA 组、NHSFs-virus’及NHSFs-AQP3cDNA组，分子量为36kd位置处均可见灰度均一的蛋白质条带，提示均有AQP3蛋白表达；分子量为42kd的内参p-Actin条带清晰，表24

0.05)； (2) NHSFs-AQP3shRNA组较NHSFs-vims组，AQP3表达水平均明显降低(P < 0.001)，如图3Aac所示；（3) NHSFs-AQP3cDNA组较NHSFs-virus’组，AQP3表达水平显著升高（P < 0.01)，如图3Bac所示。RT-PCR扩增产物经凝胶电泳可见：NHSFs组、NHSFs-virus组、NHSFs-AQP3shRNA组、NHSFs-virus’组及NHSFs-AQP3cDNA组，226bp产物片段位置可见AQP3焚光条带清晰，452bi)产物片段位置可见GAPDH条带清晰，表达均一，无其它杂带。其中，以NHSFs组的AQP3突光灰度值作为参照，（1)NHSFs-virus组较NHSFs组

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本文编号：2754055