基于多亚单位Th表位的幽门螺杆菌疫苗的研究

发布时间：2020-07-21 06:42

【摘要】：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)在全球人口中的感染率超过50%，已被确定为慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病菌，并被世界卫生组织列为胃癌的Ⅰ类致癌因子。 表位是抗原分子中决定抗原特异性的关键部分，合理组合优势表位，可诱导出比原始抗原更为高效和特异的免疫应答。H. pylori感染导致机体对H. pylori自身天然抗原产生免疫耐受，选择H. pylori保护性抗原的优势表位来构建表位疫苗，有可能打破免疫耐受，从而达到免疫预防和清除H. pylori感染的目的。前期研究证实，特异性CD4+T细胞应答在抗H. pylori感染的保护性免疫应答中至关重要。本研究通过构建H. pylori Th表位疫苗，采用先免疫后攻毒以及先感染后治疗两种方式，在动物模型上对疫苗的预防和清除的保护效果进行评价，并探讨相应的免疫应答机制。主要研究方法、结果和结论如下： 1.幽门螺杆菌Th表位的筛选和疫苗的设计 通过生物信息学的方法预测并筛选H. pylori保护性抗原HpaA、CagA和UreB的优势Th表位，共筛选到17个表位肽。动力学模拟考察不同表位连接顺序所构成蛋白的动力学和热力学稳定型，确定以HpaA表位-CagA表位-UreB表位的连接顺序来构建Th表位疫苗Epivac。 2.幽门螺杆菌Th表位疫苗的构建、表达和纯化 构建疫苗蛋白的原核表达质粒pET30a-epivac，转化至BL21(DE3)，经诱导表达和纯化，获得目的蛋白Epivac，HPLC分析蛋白纯度在90%以上。相同的技术方法制备含分子内佐剂的疫苗蛋白LTB-epivac。 3.幽门螺杆菌Th表位疫苗的免疫保护效果评价及应答分析 1)幽门螺杆菌Th表位疫苗免疫预防效果的评价及应答分析 采用鼻腔滴注和皮下注射两种免疫途径，Epivac联用不同佐剂对BALB/c小鼠进行免疫，评价疫苗的免疫预防效果。结果显示，单用疫苗以及联用佐剂都可以有效预防H. pylori感染，且联用佐剂效果更优。此外，鼻腔滴注发挥保护作用的时间点要早于皮下注射。ELISA检测特异性抗体IgG、IgA的产生；Real-time RT PCR和ELISA检测脾淋巴细胞和胃组织细胞因子的表达变化；流式细胞术定量检测抗原特异性CD4+T细胞的水平及其应答特征。结果提示疫苗的保护作用与抗体应答无关，而主要依赖于疫苗诱导的系统性和局部的Th1型CD4+T细胞应答。 2)幽门螺杆菌Th表位疫苗免疫清除效果的评价及应答分析： 利用BALB/c小鼠模型对表位疫苗的免疫清除效果进行评价。相对于未免疫组，疫苗免疫可以显著降低小鼠胃内H. pylori的定植量，具有一定的治疗效果。通过分析小鼠抗体应答的特征，推测疫苗的免疫清除作用可能与特异性Th1型细胞应答密切相关。 4.幽门螺杆菌Th表位疫苗的初步安全性评价 通过内毒素检测、急性毒性试验和豚鼠最大化试验对疫苗的安全性进行初步评价，结果显示疫苗内毒素低于限量，且鼻腔滴注和皮下注射两种给药方式不会引起机体损伤和过敏反应，初步说明疫苗是安全无毒的。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【图文】：

22图 2-1 表位不同连接顺序所构成蛋白的三维结构模拟。(A) Hepi-Uepi-Cepi的三维模拟结构 (B)Hepi-Cepi-Uepi的三维模拟结构(C) Uepi-Hepi-Cepi的三维模拟结构 (D) Cepi-Uepi-Hepi的三维模拟结构(E) Cepi-Hepi-Uepi的三维模拟结构 (F) Uepi-Cepi-Hepi的三维模拟结构.2.4.2 分子动力学模拟评价表位不同连接顺序所构成蛋白的动力学和热力学子动力学模拟过程中，蛋白的α碳原子的RMSD(Root Mean Square Deriv方根)是衡量蛋白质结构稳定性的重要参数。模拟过程中，RMSD在越短恒定状态，且RMSD值越小，一般认为这种结构的蛋白具有越强的动力2-2是表位不同连接顺序所构成的6种蛋白在分子动力学模拟过程中RMS的曲线(图2-2)。从图中可以看出，蛋白Hepi-Uepi-Cepi在模拟到500ps的时候，

差异均方根)是衡量蛋白质结构稳定性的重要参数。模拟过程中，RMSD在越短的时间内达到恒定状态，且RMSD值越小，一般认为这种结构的蛋白具有越强的动力学稳定性，图2-2是表位不同连接顺序所构成的6种蛋白在分子动力学模拟过程中RMSD随时间变化的曲线(图2-2)。从图中可以看出，蛋白Hepi-Uepi-Cepi在模拟到500ps的时候，RMSD

SDS-PAGE 检测。c 表达形式的鉴定，6000rpm 离心 10min，作时间 5s，间隔时间 5片，上清再经 12 000×3.1.3 实验结果增察 PCR 结果(图 2-1)，在定为 epivac 基因片段。

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本文编号：2764040